背景牙周炎是由菌斑微生物引起的牙周支持组织的慢性感染性疾病,是成人牙齿缺失的主要原因。人牙周膜干细胞（human periodontal ligament stem cells,hPDLSCs）作为目前牙周再生组织工程中最有希望的“种子细胞”之一,常被用于牙周骨再生的研究。大量研究证实,Wnt信号通路与成骨分化过程密切相关,但是经典和非经典Wnt信号通路与hPDLSCs的成骨分化有何关系,及其在成骨过程中的分子机制目前仍不明确。目的本课题旨在研究Wnt信号通路对hPDLSCs成骨分化的影响,探究利用hPDLSCs并调节Wnt信号通路的活化对牙周组织再生的作用及其相应的分子机制,探索利用Wnt信号通路调控实现牙周组织再生的可能性。方法1、采用酶解组织块法分离培养hPDLSCs,通过免疫荧光法鉴定细胞来源。通过诱导成骨、成脂和成软骨来检测hPDLSCs多向分化的能力。2、加入经典Wnt激动剂LiCl,先通过CCK-8和Real-time PCR确定LiCl的作用浓度和作用时间;再通过免疫荧光、核质分离结合Western Blot和双荧光素酶报告基因实验验证LiCl对经典Wnt信号通路的激活作用。将LiCl加入hPDLSCs进行诱导成骨,以同浓度Na Cl作为对照组,诱导7 d时进行碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase,ALP）染色和ALP活性测试,诱导21 d时进行茜素红染色和半定量分析,并且提取诱导7 d,14 d的对照组和实验组的RNA,通过Real-time PCR分析二者成骨相关基因和Wnt相关基因的表达差异。3、通过转染质粒获取Wnt 3a、4、5a、7a、7b和对照条件培养基,将上述条件培养基加入hPDLSCs中,通过CCK-8检测细胞增殖情况。通过免疫荧光和双荧光素酶报告基因实验观察Wnt条件培养基对经典Wnt信号通路传导的影响。应用Wnt条件培养基诱导hPDLSCs成骨分化,诱导7 d时进行ALP染色和ALP活性测试,诱导14 d时进行茜素红染色和半定量分析;提取诱导7 d的对照组及实验组的RNA,通过Real-time PCR分析成骨相关基因的表达量,检测加入Wnt条件培养基后对hPDLSCs成骨分化的影响。结果1、成功分离培养出hPDLSCs,其具有长梭形的形态。免疫荧光显示,细胞表达波形蛋白,不表达角蛋白,源于间充质,并具有多向分化的潜能。2、免疫荧光、核质分离结合Western Blot和双荧光素酶报告基因实验证实8m M LiCl（不影响hPDLSCs增殖）激活了经典Wnt信号通路。在hPDLSCs中加入8 m M LiCl后,与对照组相比,诱导7 d后实验组的ALP染色颜色较浅,ALP活性较低;诱导21 d后,实验组中被茜素红染红的沉积钙盐明显减少;Real-time PCR结果显示,实验组成骨相关基因表达下降,表明hPDLSCs成骨分化能力较对照组下降。3、荧光显微镜和Western Blot结果显示成功制备了Wnt 3a、4、5a、7a、7b条件培养基。选取不影响hPDLSCs增殖的10%Wnt条件培养基用于实验。免疫荧光和双荧光素酶报告基因实验表明10%Wnt 7a条件培养基增加了核内β-catenin的表达,但不影响下游TCF转录。分别加入10%的对照和Wnt条件培养基后,成骨相关实验检测结果表明Wnt 3a、5a、7a、7b条件培养基提高了hPDLSCs成骨分化过程中ALP的表达水平,而对hPDLSCs成骨分化形成的矿化结节量无明显影响。结论1、加入LiCl激活经典Wnt信号通路后,hPDLSCs的成骨分化能力随之降低。2、Wnt 7a条件培养基增加了hPDLSCs核内β-catenin的表达。Wnt 3a、5a、7a、7b条件培养基提高了hPDLSCs成骨分化过程中ALP的表达水平,但Wnt条件培养基对hPDLSCs成骨矿化的影响作用尚无确切定论。