背景和目的结直肠癌是常见的消化道肿瘤,随着其发病率及其死亡率的逐年攀升,肠道肿瘤给人们造成的健康威胁日趋严重。结肠癌疾病的发生与高脂肪低纤维饮食、结肠炎、遗传环境等因素有关,其发生发展是多因素、多阶段、多分子变化逐渐累积的复杂演变过程。结肠腺癌（Colon Adenocarcinoma,COAD）是结肠癌中最常见的类型,约占结肠癌总数的4/5以上。近年来,结肠癌检测手段推陈出新,靶向治疗、免疫治疗等治疗策略不断发展,精准施治成为当前结肠癌诊疗发展的大趋势。但是,结肠癌肝转移、BRAF突变等类型的结肠癌患者疗效较差,一直是临床上亟待解决的难题,迫切需要寻找新的治疗策略来改善患者预后。去整合素金属蛋白酶家族（A Disintegrin And Metalloproteinase,ADAM）,是一类包含去整合素和金属蛋白酶结构域的蛋白分子。这个家族的蛋白在多种肿瘤中高表达,主要通过影响肿瘤细胞之间和细胞外基质的粘附、蛋白水解以及调节肿瘤细胞的信号传导、诱导肿瘤血管的生成等,参与调控肿瘤的发生发展,因此ADAM家族与癌症的发生发展有着紧密的联系。去整合素金属蛋白12（ADAM12）于染色体10q26上,是一种跨膜蛋白,可以调控多种肿瘤细胞的增殖、凋亡及耐药。但是关于ADAM12在结肠腺癌中的作用却罕有报道。基于以上背景,我们通过交叉对比TCGA、GEO的结肠腺癌数据集,筛选出在结肠腺癌中的差异表达基因ADAM12;结合数据库分析的结果及组织芯片的验证,明确ADAM12在结肠腺癌中的表达及其与生存预后的关系;通过体内外细胞功能实验,探究ADAM12对结肠腺癌细胞系生物学行为的影响;利用生信分析及双荧光素酶报告等实验,预测并验证了参与表达调控的转录因子及其潜在的结合位点,阐明ADAM12在结肠腺癌高表达的调控机制;通过基因富集分析（Gene Set Enrichment Analysis,GSEA）、相互作用蛋白的验证及相关功能回复实验,对ADAM12在结肠腺癌细胞系中发挥促癌作用的下游机制进行深入探讨与验证。本课题旨在研究ADAM12在结肠腺癌中的表达与临床意义、生物学功能及其作用机制,为结肠腺癌的靶向治疗提供新思路。第一部分ADAM12在结肠腺癌中的表达及临床意义方法1.采用微阵列线性模型（Linear Models for Microarray）和 RNA-Seq Data（Limma）包,以p＜0.001和log2|foldchange|＞2.5为筛选标准,分析TCGA数据库中COAD数据集、GSE62321和GSE146587数据集中的差异表达基因。2.分析TCGA数据中ADAM12在不同结肠癌分期、亚型中的表达差异,进一步确认表达情况。在GSE38832中分析ADAM12的表达情况与生存期的关系。通过The human protein atalas（HPA）在线数据库检验ADAM12在结肠癌组织中的蛋白表达情况。3.利用免疫组化检测组织芯片中ADAM12的表达情况,根据患者临床资料,应用卡方检验或者Fisher精确检验分析其与临床病理参数的相关性,Kaplan Meier生存曲线、log-rank检验用来评价比较两组患者生存期的差异。结果1.通过交叉对比三个结肠腺癌数据集中的差异基因,筛选得到了共同的差异基因FOXQ1、CLDN1、INHBA、CTHRC1、ADAM12、KRT80,选择在结肠腺癌中功能未明确的、前期预实验结果较好的ADAM12进行后续研究。2.ADAM12 在TCGA-COAD、GSE62321 和GSE146587 中的癌组织均为高表达。并且ADAM12在结肠腺癌高分期中的表达高于低分期。ADAM12在结肠粘液腺癌中的表达高于腺癌。HPA数据库的结果证实:ADAM12蛋白在结肠癌组织中高表达。ADAM12高表达的结肠腺癌患者预后较差。3.82例结肠腺癌患者中,ADAM12表达为强阳性的有40例,弱阳性的为42例,ADAM12的表达与年龄、性别、肿瘤大小无相关性,与临床分期、肿瘤浸润深度（T）、淋巴结转移（N）、远处转移（M）相关,p值分别为0.003、0.024、0.001、0.011。ADAM12强阳性肿瘤患者的总生存率显著低于ADAM12弱阳性肿瘤患者。小结1.ADAM12的表达在结肠腺癌组织中显著升高;2.ADAM12高表达的结肠腺癌患者预后差,并且与远处转移、浸润深度、淋巴结转移、临床分期相关,提示ADAM12可能参与了结肠腺癌的发生发展。第二部分ADAM12在结肠腺癌中的生物学功能研究方法1.利用蛋白免疫印迹（Western Blot）和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测几种常见结肠腺癌细胞株SW48、SW620、HCT116、SW480、SW1116中ADAM12的表达水平。2.应用过表达慢病毒转染本底表达量较低的HCT116细胞、SW480细胞,利用敲低慢病毒转染本底表达量高的SW48细胞,经嘌呤霉素筛选成稳定转染的细胞株后检测ADAM12mRNA和蛋白水平来验证细胞株是否构建成功。3.分别采用CCK8实验、EdU实验、Ki-67的mRNA检测、克隆形成实验和Annexin V-APC/7-AAD双染流式检测和Caspase3/7活性检测、细胞周期检测等实验手段,对比过表达或者沉默ADAM12对结肠癌细胞株增殖、凋亡、周期以及克隆形成能力的影响。4.通过裸鼠体内荷瘤实验,观察HCT116细胞的ADAM12过表达组与对照组之间成瘤能力的差异,并用免疫组化检测肿瘤组织中Ki-67阳性比例的变化。结果1.ADAM12在SW48、SW1116中表达相对较高,SW620中表达较低,SW480、HCT116仅有微弱表达,蛋白水平与mRNA水平一致。2.利用本底表达量较低的HCT116和SW480细胞,成功构建了两株稳定过表达ADAM12的细胞系;利用本底表达量较高的SW48细胞建立了稳定敲低ADAM12的细胞系。3.敲低ADAM12后,SW48细胞的CCK8检测的OD值明显降低（p＜0.01）,细胞的克隆形成数目明显减少（p＜0.001）,EdU阳性细胞的百分比降低,Ki-67的mRNA表达降低（p＜0.001）,细胞凋亡比例和Caspase3/7活性均增加（p＜0.05）,细胞阻滞于G0/G1期,进入S期的比例减少（p＜0.01）;HCT116、SW480过表达组与对照组的细胞对比,过表达组细胞增殖速度显著增加（p＜0.01）,克隆形成能力明显增强（p＜0.01）,凋亡比例、Caspase3/7活性均降低（p＜0.05）,细胞周期处于S期的比例增多（p＜0.01）。4.裸鼠荷瘤实验的结果显示,过表达与对照组相比,皮下肿瘤的生长速度明显增快,瘤体体积和质量也更大（p＜0.05）,Lv-NC、Lv-ADAM12组的Ki-67阳性率分别为（34.67±5.03）%、（79±8.54）%,增殖活性明显增加（p＜0.01）。小结ADAM12能促进结肠腺癌细胞增殖、周期进展、减少细胞凋亡,并且增加细胞克隆形成能力及体内成瘤能力。第三部分ADAM12在结肠腺癌中表达的调控机制方法1.使用R软件在GSE147571数据集中进行相关性分析,通过计算相关性系数,筛选出与ADAM12表达相关性最高的基因,根据基因功能和文献报道,筛选出目标转录因子;使用GEPIA网站对ADAM12与筛选得到的转录因子进行相关性分析验证。2.在HCT116、SW480、SW48中转染过表达质粒或siRNA,上调或者下调该转录因子的表达后,分别检测ADAM12mRNA和蛋白水平的表达变化。3.通过Ensembl、JASPAR数据库分析转录因子与ADAM12启动子区是否能结合及具体结合的位点。4.构建含有野生型ADAM12的启动子区以及在MEF2A结合位点突变双荧光素酶报告基因载体,分别与MEF2A过表达质粒或者对照质粒共转染,36h后检测荧光素酶报告基因活性。结果1.在与ADAM12相关性较高的前50位基因中,MEF2A是唯一的转录因子,GSE147571和TCGA-COAD数据库中基因表达的相关性分析提示MEF2A与ADAM12的表达呈正相关（p＜0.001）。2.过表达MEF2A,ADAM12的mRNA和蛋白表达上调;而MEF2A的沉默引起ADAM12的mRNA和蛋白表达下降（p＜0.01）。3.ADAM12的启动子区存在两个潜在的MEF2A结合位点,位于相对于转录起始位点的-618bp至-608bp以及-908bp至-898 bp。4.MEF2A能促进野生型ADAM12启动子的激活（p＜0.001）;MEF2A与ADAM12启动子两个结合区域中任何一个位点的突变均能降低荧光素酶的活性,而两个位点同时突变则可以完全阻断荧光素酶的活性。小结1.ADAM12与MEF2A的表达呈正相关;2.MEF2A通过转录激活ADAM12的启动子正向调控其表达。第四部分ADAM12在结肠腺癌中的作用机制研究方法1.利用GSE147571中308例结肠癌的标本的数据,根据ADAM12的表达高低进行排序,通过GSEA,找寻ADAM12的相关调控通路。2.分别用不同剂量（0、0.5、1、2μg）的FLAG-ADAM12质粒转染HCT116细胞12h后,4组细胞再加入pNFκB-luc和pSV40-renilla质粒共转染24h,根据测得的荧光素酶活性分析NF-κB信号通路激活水平;用同样的方法在SW48中转染Con-siRNA、ADAM12-siRNA#1、ADAM12-siRNA#2,12h后加入pNFκB-luc和pSV40-renilla质粒共转染24h,检测下调ADAM12表达对NF-κB荧光素酶活性的变化。通过qRT-PCR检测HCT116细胞上调或者SW48细胞下调ADAM12表达后,NF-κB通路下游的两个靶基因c-Myc、Cyclin D1和两种炎症细胞因子TNF-α、IL-1β的相对表达量。3.通过BioGRID、INTACT和HitPredict 3个数据库对ADAM12的相互作用蛋白进行预测分析,根据GSEA结果及相关文献报道,确定研究对象。采用免疫共沉淀实验（Co-IP）及GST pull-down,检测ADAM12、HOXA1、RBCK1 之间的相互作用情况。4.在HCT116细胞中分别构建过表达ADAM12、敲低HOXA1、过表达ADAM12同时敲低HOXA1的稳转细胞株,用pNFκB-luc和pSV40-renilla质粒转染各组细胞36h,检测各组诱导的NF-κB荧光素酶活性的变化,比较下调HOXA1的表达能否影响ADAM12过表达导致的NF-κB信号通路激活;采用CCK8实验、Ki-67 mRNA表达检测、EdU细胞增殖检测、克隆形成实验,比较下调HOXA1的表达能否影响ADAM12对HCT116细胞的促增殖作用。5.用SW48细胞分别构建敲低ADAM12、过表达HOXA1、过表达HOXA1同时敲低ADAM12的稳转细胞株,用pNFκB-luc和pSV40-renilla质粒转染各组细胞36h,然后检测各组诱导的NF-κB荧光素酶活性的变化,比较上调HOXA1的表达能否影响ADAM12沉默导致的NF-κB信号通路活性降低;通过CCK8实验、Ki-67 mRNA表达检测、EdU细胞增殖检测、克隆形成实验等,比较上调HOXA1的表达能否影响ADAM12沉默对SW48的增殖抑制作用。结果:1.GSEA 结果显示 TNFASIGNALINGVIANFKB 相关基因在 ADAM12 高表达组中出现显著的富集,提示了ADAM12的促癌作用可能与NF-κB信号通路的激活有关。2.随着不同程度上调ADAM12的表达,HCT116细胞中NF-κB的转录活性出现相应趋势的增高（p＜0.01）,NF-κB信号通路激活水平增加。NF-κB下游的两个靶基因c-Myc、Cyclin D1和两种炎症细胞因子TNF-α、IL-1β的mRNA表达量也增加（p＜0.01）;相反,ADAM12敲低后,SW48细胞中NF-κB荧光素酶活性降低,c-Myc、Cyclin D1 及TNF-α、IL-1β的表达水平下调（p＜0.01）。3.将与NF-κB通路密切相关的HOXA1蛋白作为研究对象。HCT116细胞中,FLAG-ADAM12免疫沉淀物中检测到HOXA1的表达;在SW48细胞中,Co-IP实验进一步证实了内源性表达的ADAM12能与HOXA1结合;GST pull-down实验中,对照组GST蛋白的泳道不能检测到ADAM12的蛋白条带,GST-HOXA1融合蛋白的泳道能检测到ADAM12蛋白;在细胞中过表达ADAM12,“诱饵蛋白”HOXA1沉淀下来的RBCK1蛋白明显比对照组少。4.在HCT116细胞中,ADAM12诱导的NF-κB通路活化显著增加,而同时敲低HOXA1可以抑制ADAM12对NF-κB通路的激活作用（p＜0.01）;相反,在SW48细胞中,下调ADAM12导致的NF-κB通路的激活能力降低能被上调的HOXA1 回复（p＜0.001）。5.下调HOXA1抑制了ADAM12对HCT116细胞的促增殖作用,ADAM12过表达同时敲低HOXA1处理组的细胞与ADAM12过表达组相比,CCK8的OD值、EdU阳性百分比、Ki-67mRNA的表达水平及克隆形成数均明显降低（p＜0.01）;上调HOXA1可以回复ADAM12敲低对SW48细胞增殖的抑制作用,ADAM12敲低同时过表达HOXA1处理组的细胞与ADAM12敲低组相比,CCK8的OD值、EdU阳性百分比、Ki-67 mRNA的表达水平及克隆形成数平均明显升高（p＜0.05）。小结:1.ADAM12的促癌作用与NF-κB信号通路的激活有关;2.HOXA1是ADAM12的相互作用蛋白;3.ADAM12通过调节HOXA1与RBCK1之间的相互作用,激活NF-κB通路,从而促进结肠腺癌细胞增殖。全文结论1.ADAM12在结肠腺癌组织中表达上调,其高表达与远处转移、浸润深度、淋巴结转移、临床分期及不良预后相关,提示ADAM12可能参与了结肠腺癌的发生发展;2.ADAM12能促进结肠腺癌细胞增殖、周期进展、减少细胞凋亡,并且增加细胞克隆形成能力及体内成瘤能力;3.MEF2A通过识别并特异性结合ADAM12启动子区域-618bp至-608bp以及-908bp至-898 bp的位点,从而调控其转录;4.ADAM12通过调节HOXA1和RBCK1之间的相互作用,激活NF-κB信号通路,从而促进结肠腺癌细胞增殖。