中国大鲵Sox2和Sox19基因cDNA全长克隆及其组织表达分析

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中国大鲵是地球上生存至今体形最大的两栖动物,是我国独有的稀有物种,已经被列入国家二级保护动物名录中,还被列入CITES公约附录Ⅰ中。中国大鲵在药用、科研、食用、观赏等方面具有重要的开发和研究价值。Sox基因家族是参与个体发育与分化的基因家族,是进化过程中高度保守的基因家族。对Sox基因家族进行研究可以揭示动物性别决定与分化的分子机制、胚胎发育的调控及多种组织器官发生发育过程的调控机制,也可以为一些疾病的诊断和治疗提供分子依据。本实验对中国大鲵Sox2和Sox19基因进行克隆,对其生物学特性进行初步分析,并研究其组织表达情况,为后续的进一步了解中国大鲵Sox2和Sox19基因的结构和功能打下基础,也为用分子生物学方法揭示中国大鲵系统进化、性别决定与分化的分子机制和胚胎发育的调控等打下基础。本论文利用RACE技术,扩增得到了中国大鲵Sox2基因的cDNA全长,全长为2233bp,开放阅读框共963bp,编码320个氨基酸。对中国大鲵Sox2基因的cDNA全长在NCBI上的BLAST在线分析结果表明:其与红腹蝾螈(Cynops pyrrhogaster)和东美螈(Notophthalmus viridescens)的相似度较高分别为89%和88%,与非洲爪蟾(Xenopus laevis)、小鼠(Mus musculus)、人(Homo sapiens)、马(Equus caballus)、猫(Felis catus)、水牛(Bubalus bubalis)、原鸡(Gallus gallus)的相似度在76%-82%之间,与鱼类的相似度较低在20%-40%之间。将Sox2基因所编码的蛋白质用相同方法进行分析,结果显示其与红腹蝾螈I(Cynops pyrrhogaster)相似度最高为92%,与小鼠(Mus musculus)、非洲爪蟾(Xenopus laevis)、大西洋鲑(Salmo salar)、黄腊鲹(Trachinotus blochii)、人(Homo sapiens)、马(Equus caballus)、原鸡(Gallus gallus)等物种的相似度在69%-80之间。本论文还选取不同物种Sox2基因蛋白质序列,基于本研究中所克隆中国大鲵Sox2基因的蛋白质序列,利用MEGA5.0软件,采用邻接法(Neighbor-joining method)重复10000次构建系统发育树,结果显示:中国大鲵与东美蝾和红腹蝾螈聚成一支;鱼类自成一大支;非洲爪蟾和热带爪蟾与哺乳类和鸟类共在一个大支,但是处于不同的分支。表明其与东美蝾和红腹蝾螈的进化关系更为接近,基本符合物种进化的历程。本论文利用RACE技术,扩增得到了中国大鲵Sox19基因的cDNA全长,全长为1290bp,开放阅读框共858bp,编码285个氨基酸。中国大鲵Sox19基因的cDNA全长在NCBI上的BLAST在线分析结果表明,其与红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)相似度为85%,与比目鱼(Hippoglossus)相似度为87%;用DNAMAN与小家鼠(M.musculus)进行比对相似度为8%。将中国大鲵Sox19基因所编码的蛋白质用相同方法进行分析,结果显示其与红鳍东方纯(Takifugu rubripes)相似度为55%,与斑马鱼(Danio rerio)相似度为58%,与舌齿鲈(Dicentrarchus labrax)相似度为64%:与小家鼠(M.musculus)相似度为12%。分析结果显示中国大鲵与其他物种的Sox19基因相似度比较低,且蛋白质序列的相似度并没有高于核苷酸序列的相似度,但是,通过比对发现Sox19基因的HMG盒在各物种之间还是很保守的。选取不同物种Sox19基因蛋白质序列,基于本研究中所克隆中国大鲵Sox19基因的蛋白质序列,利用MEGA5.0软件,采用邻接法重复10000次构建系统发育树,结果显示,中国大鲵单独聚成一支;鱼类自成一大支;小家鼠单独成一支。分析结果得知:中国大鲵与鱼类的进化关系相对哺乳类更为接近,基本符合物种进化的历程。本论文还基于中国大鲵Sox2和Sox19基因的cDNA序列,对中国大鲵的心脏、肾脏、卵巢和肠道组织做了表达谱分析。结果表明,中国大鲵Sox2基因在卵巢中的表达量最高,肾脏中次之,在肠道中表达极低;中国大鲵Sox19基因在心脏中的表达量最高,卵巢中次之,在肾脏和肠道中的表达量相近,在肾脏中的表达量略高于肠道。
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