恶性肿瘤严重威胁人类的生存和健康,其治疗手段主要是手术切除后,联合化疗,放疗和免疫治疗等。由于化疗药物的非选择性,对肿瘤细胞产生作用的同时也对正常细胞产生较强的毒副作用,导致化疗效果不佳。制备应用良好生物相容和靶向性的抗肿瘤药物载体,通过定位的缓释作用,继能减少药物使用量,又能提高局部药物浓度,达到减轻全身毒副作用,是提高肿瘤化疗效果的发展方向。红细胞作为抗癌药物多柔比星(Doxorubicin,DOX)载体可减少用药量和提高疗效,但其靶向性差。设想用红细胞双载DOX和纳米级Fe3O4磁流体(Fe3O4 nano-magnetic ferrofluid,MF),借助于外加磁场以解决DOX红细胞载体的靶向问题。电穿孔法制备细胞药物载体具有较高的效率包载率。建立电穿孔制备磁化载体红细胞的方法,探讨磁流体磁化红细胞及相关载体制备最佳实验条件及分离与鉴定方法,观察和分析磁化红细胞(即单载MF红细胞,MF载体红细胞)的磁化现象及磁化DOX载体红细胞(即双载DOX及MF红细胞)的磁化率及载药参数,体外相关生物学和物理学特性,比较双载磁化DOX红细胞和单载磁化红细胞的磁化率,为红细胞靶向治疗肿瘤提供实验方法,为进一步应用性研究积累实践经验。一、磁化红细胞制备的优化实验研究(一)方法1、选择最佳实验条件:通过对不同粒径颗粒磁流体的分散性和其性质筛选比较,选择合适大小和易于观察的磁流体,建立电穿孔法制备制备MF载体红细胞;研究MF浓度与磁响应性关系、RBC与MF的比例、不同电压,脉宽,电击频率,电场强度,热孵对实验结果的影响、比较优化载体制备条件。2、选择最佳分离条件:比较不同的离心转速和时间,选择将未载入红细胞的磁流体从反应体系中移除的最适方法。3、选择合适的鉴定方法:比较涂片技巧、磁化红细胞终产物在普通显微镜、荧光显微镜,染色、电镜观察等方法,选择鉴定红细胞是否已被磁化的适合检测方法。4、选择合适的磁流体:比较两种不同修饰剂的磁流体的分散性和磁流体特性,选择符合磁化红细胞条件的磁流体。5、以自动细胞分析仪测定全血、洗涤和载体红细胞的数量、平均容积(MCV)、平均血红蛋白含量(MCHC)等指标,考察载体红细胞回收率等载药参数及生理特性的变化情况。比较磁化红细胞的贮存稳定性。(二)结果1、带有荧光标记的磁流体fluidMAG-D和fluidMAG-DP,直径100nm,为最佳实验磁化材料,500V,100μs,10P(电场强度为2.5KV/cm)为电穿孔法最佳实验条件。红细胞浓度为109/ml,磁流体浓度为15μg/ml,红细胞和MF的比例为1:1,37℃热孵30min可以增加红细胞的稳定性。2、通过低速离心800转5分钟的方法分离去除未包载入红细胞的磁流体。3、通过质控方法的改进、观察实验终产物直接涂片、荧光显微镜、透射电镜等方法证明红细胞已被磁化。4、选择带荧光标记的fluidMAG-D和fluidMAG-DP作为磁化剂,便于观察和定量测定。5、磁化红细胞回收率为(67.50±4.55)%,MCV减小(4.00±1.06)%,血红蛋白含量减少(18.12±3.27)%。磁化红细胞稳定贮存可达5天。二、磁化DOX载体红细胞制备的优化实验研究(一)方法1、比较不同浓度DOX对电穿孔法制备磁化DOX载体红细胞的影响,摸索建立制备磁化DOX载体红细胞的最佳方法并优化实验条件。2、HPLC法测定磁化红细胞内外DOX的含量,初步确定DOX的包载率。自动细胞分析仪测定载体红细胞的数量、平均容积(MCV)等指标,比较DOX浓度与平均血红蛋白含量(MCHC)、载体红细胞回收率之间的关系并考察生理特性的变化情况。比较磁化红细胞的贮存稳定性。3、FCM分析磁化DOX红细胞的平均荧光强度,以半定量确定红细胞的磁化率。(二)结果1、以电穿孔法同时包载DOX、MF,红细胞浓度为109/ml,磁流体浓度为15μg/ml,DOX浓度为2mg/ml,体积比为1:1:1,电穿孔后37℃孵育30分钟。此条件为制备磁化DOX载体红细胞的最佳方法。2、当红细胞、DOX、MF三者比例1:1:1、包载效果最好。通过低速离心法分离未包载入红细胞的磁流体。直接涂片、荧光显微镜、透射电镜、流式细胞检测等方法证明红细胞已被磁化。3、磁化DOX红细胞的平均荧光强度为19±5.8,高于单载DOX红细胞的平均荧光强度12±4.6,磁化效果显著。(三)结论1、以电穿孔法和适合的磁流体品种制备磁化红细胞可行,载药参数良好,载体红细胞生理特性无明显改变,为进一步探讨红细胞靶向治疗肿瘤提供理论和实验依据。2、以电穿孔法同时包载DOX、MF制备MF+DOX载体红细胞可行,实验条件与单载MF红细胞制备条件基本一致,红细胞浓度为109/ml,磁流体浓度为15ug/ml,DOX浓度为2mg/ml,红细胞、DOX、MF三者体积比例1:1:1时是最佳浓度配比。双载红细胞与磁化红细胞回收率及生理特性无明显改变,红细胞能够作为抗癌药靶向治疗肿瘤的载体。3、双载红细胞MCV减小(6.20±2.31)%,血红蛋白含量减少(25.04±4.55)%,载体红细胞回收率(59.16±6.15)%。磁化DOX载体红细胞在PBS中稳定贮存可达4天。双载红细胞MCV、稳定贮存时间与磁化红细胞无明显差异。三、比较单载磁化红细胞和磁化DOX载体红细胞物理性能的实验研究(一)目的比较电穿孔法制备磁化红细胞和磁化DOX双载红细胞的磁响应性,判断DOX对电穿孔法制备红细胞载体的影响,为进一步改善电穿孔制备磁化红细胞载体的磁化率研究提供理论依据,为临床输血靶向治疗肿瘤提供一种新的思路和选择。(二)方法提取第一遍洗涤上清液,和红细胞破坏后离心所得上清液,HPLC测定DOX含量的方法,分析DOX载体红细胞内外的药物浓度,同时观察溶血情况,比较红细胞的贮存稳定性,使用VSM检测磁化DOX载体红细胞的磁滞度曲线,确定其具有磁相应性。采用流式细胞仪分析法,对以标有黄绿色荧光的磁流体,磁化红细胞的磁化DOX双载红细胞的平均荧光强度进行分析比较。确定DOX对磁化红细胞的影响。(三)结果DOX载体红细胞的体外特性红细胞平均容积没有明显变化,血红蛋白含量减少(25±7.66)%,前2小时药物释放为(15.64±1.13)%,随时间延长,释放率加大,贮存稳定可达4天。VSM检测磁化DOX红细胞表明,红细胞成功报载了磁流体,具有铁磁性物质所具有的磁滞现象,在改变磁场强度大小与方向的情况下,形成一条封闭的磁滞曲线。在不同大小与方向的磁场下,磁化载体红细胞具有不同的磁化强度,充分表明磁化DOX载体红细胞在体外具有一定的磁响应性。FCM结果同样证实红细胞被成功磁化。双载DOX磁化红细胞的平均荧光强度比单载磁化红细胞高(26.3±7.89%),单载磁化红细胞、双载DOX磁化红细胞组与未载药和磁化组相比差异均显著。(四)结论DOX载体红细胞细胞内浓度约为细胞外浓度的两倍,细胞载药参数良好,载药量较高。普通显微镜下观察,载体红细胞与载药前无明显形态学改变,荧光显微镜下观察,多数红细胞内和边缘有弱或中等强度的黄绿色荧光。说明标有荧光的磁流体进入红细胞内,红细胞磁化效果较好。VSM测定证明磁化载体红细胞具有明显磁滞现象,在体外具有一定的磁响应性。FCM检测证实磁化红细胞具有荧光,双载DOX载体红细胞的磁化率高于单载磁化红细胞,DOX对电穿孔法制备磁化载体红细胞的磁化率具有增强作用,并且与其浓度呈正相关。