研究背景霍乱是由霍乱弧菌引起的一种烈性肠道传染病,具有发病急、传播快、波及范围广等特点,主要引起无痛性水样腹泻,病例往往因未得到及时治疗而导致严重脱水,甚至中毒死亡。霍乱是国际检验疾病,在我国属于甲类传染病,目前仍然是发展中国家危及人群生命与健康的主要公共卫生问题。到目前为止,霍乱弧菌发现有200多个血清群,只有O1群和O139群可引起霍乱的暴发和流行。非O1/O139群霍乱弧菌是指除O1和O139群霍乱弧菌以外的其他血清群的霍乱弧菌。以往研究认为,非O1/O139群霍乱弧菌不致病或者仅引起散在的轻度腹泻。近年来,有报道发现有些非O1/O139群霍乱弧菌也可产生霍乱肠毒素,从而引起人类腹泻并时有暴发流行,因此逐渐受到细菌学家和流行病学家的广泛关注。非O1/O139群霍乱弧菌广泛存在于环境中,尤其是外环境水体和海水产品中,其引发的临床症状与霍乱相似,主要为水样便、轻微腹痛、不发热或低热,临床医生常难以鉴别。近年来,世界各地关于非O1/O139群霍乱弧菌引起的食物中毒的报道屡见不鲜,鉴于其在食品安全中的风险,2015年我国食品安全风险评估方案中正式将非O1/O139群霍乱弧菌列入监测范围。自1817年世界上首次出现霍乱疫情以来,至今,霍乱已经引起了七次世界大流行,其中,1961年开始的由E1 Tot霍乱弧菌引起的第七次霍乱世界大流行源于印度尼西亚的苏拉威西岛,同年7月传至我国广东,至今已有50余年仍无停歇的迹象,波及五大洲的140多个国家和地区。霍乱弧菌在广东省的流行主要是以O1群为主,O139群自1993年出现后,主要引起的是散发或小型暴发。在1961年到2000年之间,广东省的霍乱流行情况比较严重,容易出现波及全省的大范围流行,病死率较高,进入2000年以后,霍乱得到了基本的控制,以局限性的暴发和散发为主,并逐渐进入霍乱流行的间歇期。在霍乱流行的间歇期,感染性腹泻监测中,我们经常会发现一些病例标本中出现非O1/O139霍乱弧菌,这些菌株可通过获得霍乱肠毒素基因等致病因子而得到毒力的进一步加强,并可能出现新的类似O139血清群的流行菌株而引起新的霍乱流行,因此,在霍乱流行间歇期,密切监测非O1/O139群霍乱弧菌并分析其分子特征,对于减少由这种病原体引起的新的流行,以及减轻其引起的感染性腹泻的疾病负担非常有必要。研究目的和意义1.比较分析广东省霍乱流行期和流行间歇期,不同来源的非O1/O139群霍乱菌株菌株分子特征。2.在分子水平上了解不同流行态势下,非O1/O139群霍乱弧菌毒力基因的携带情况,并探讨其流行规律。3.探讨不同PFGE克隆型与毒力基因携带情况的相关性,确定霍乱菌株的分子流行病学特征,为追踪菌株的来源和变迁,疫情态势评判提供科学、客观的依据。研究方法1.运用流行病学基本理论,描述1985～2013年广东省不同来源的219株非O1/O139群霍乱弧菌菌株分布特征。2.采用传统的生化鉴定和血清分型试验对菌株进行复核鉴定。3.运用PCR的方法检测CTX基因元件(ctxB、rstR4、rstR6、rstR232、rstR-18、 rstR264、rstRclac、rstRclass、rstREITor)、VPI毒力岛(tcpI、tcpAElTor)、VSP-Ⅰ (O175、 0178、0180、O183、O185)、VSP-Ⅱ (O490、O493、O498、O502、0504、O512、0514. O516)以及其它毒力基因(chxA、VCS(N2)、SXT、ST、rtxA、IS1004, hlyA、mshA)。4.采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法对菌株进行分子分型,并用BioNumerics软件进行聚类分析。研究内容1.流行病学信息：将收集的219株非O1/O139群霍乱弧菌菌株基本信息运用流行病学基本理论进行描述性研究,分析不同年代、不同地区及不同来源的菌株分布情况,进一步比较广东省非O1/O139群霍乱菌株菌株的优势菌群和流行趋势及变化。2.菌株的复苏培养鉴定及血清分型：将广东省疾病预防控制中心菌种库中非O1/O139群霍乱弧菌冷冻干燥菌株进行复苏,纯培养后进行生化鉴定及血清分型。比较分析不同流行期间广东省非O1/O139群霍乱弧菌菌株血清型分布情况。3.毒力基因检测：应用PCR方法对CTX基因元件(ctxB、rstR4、rstR6、rstR232、 rsrR-18、rstR264、rstR、rstRclac、rstRclass、rstREITor)、VPI毒力岛(tcpI、tcpAEI Tor)、VSP-I(O175、O178、0180、O183、0185)、VSP-Ⅱ (O490、0493、 O498、O502、O504、O512、0514、0516)以及其它毒力基因(chxA、VCS(N2)、 SXT、ST、rtxA、IS1004、hlyA、mshA)进行检测,计算阳性率及毒力基因型别,分析广东省非O1/O139群霍乱弧菌毒力基因携带情况,为进一步研究非O1/O139群霍乱弧菌致病机理提供基础数据。并进一步比较分析广东省1985～2013年间,不同年代、不同地区、不同来源收集的非O1/O139群霍乱菌株携带的毒力基因情况,在分子水平上了解非O1/O139群霍乱弧菌毒力基因的分布特点和变迁,探讨其流行规律。4.PFGE分子分型：采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法对菌株进行分子分型,并运用Bionumerics 6.6软件将PFGE带型比对分析,计算相似度,绘制PFGE聚类图谱。探讨不同PFGE克隆型与毒力基因的关联,追踪菌株的来源和变迁。主要结果219株非O1/O139群霍乱弧菌主要分布在霍乱大流行期间,其中,1985～1989年分离到的非O1/O139群霍乱弧菌131株,为病人来源(110株)和外环境水体来源(21株),并主要分布在湛江(67株)、广州(20株)、汕头(16株)、海口(14株)((1988年海南独立成省,之前都隶属于广东省)地区；1990～1999年,非O1/O139群霍乱弧菌菌株31株,病人(17株)、外环境水体(11株)以及水产品(3株)来源均有检出,且主要分布在阳江(13株)和广州(7株)地区；自2001后,非O1/O139群霍乱弧菌菌株数目已连续4年呈下降趋势,2007年出现小幅度回升,2012年又有一定的上升,各地区呈散在分布。血清分型结果显示,219株非01/0139群霍乱弧菌分属于VBO2,4,6,7,8,10,11,12,13,14,18,22,23,25,28,29,30,32,38,39,45,46,51,71,76,84,140,141和155共29个血清型,血清型较分散复杂,分型率达27.40%,远低于已发现的200个以上非O1/O139群霍乱弧菌血清型范围。毒力基因分析结果显示,仅13株非O1/O139群霍乱弧菌菌株含有ctxB毒力基因,经进一步测序后发现均为EL Tor型,其中病人来源占76.92%(10/13),外环境水体来源占23.08%(3/13)。其中,1985-1987年霍乱大流行期间监测到7株病人来源的非O1/O139群霍乱弧菌产毒株,1996和1998年也监测到2株病人来源的非O1/O139群霍乱弧菌产毒株,1999年监测到3株外环境水体来源的非O1/O139群霍乱弧菌产毒株,而2000年后的监测中己无非O1/O139群霍乱弧菌产毒株检出。33株非O1/O139群霍乱弧菌携带不同种类的rstR毒力基因,15株非O1/O139群霍乱弧菌tcpA阳性,同时检测到tcpl也是阳性。CTX性噬菌体及TCP毒力基因分布情况为：ctxB+rstR+tcpA+tcpI+(n=13), ctxB-rstR+tcpA-tcpI+ (n=18),ctxB-rstR+tcpA+tcpI+(n=2).病人来源的菌株中48.32%(72/149)携带不同种类的VSP岛毒力基因,其中,仅有3株携带完整的VSP毒力岛基因,其他菌株均携带部分VSP-Ⅰ或者VSP-Ⅱ毒力岛基因；外环境水体来源的菌株中46.43%(26/56)携带不同种类的VSP毒力岛基因,其中,仅有1株携带完整的VSP毒力岛基因,其他菌株均携带部分VSP-Ⅰ或者VSP-Ⅱ毒力岛基因；水产品来源的菌株中64.29%(9/14)携带不同种类的VSP毒力岛基因,没有携带完整的VSP毒力岛基因的菌株,均携带部分VSP-Ⅰ或者VSP-Ⅱ毒力岛基因。8个潜在毒力基因检测结果显示,病人来源菌株中35.57%(53/149)含有chxA毒力基因,62.42%(93/149)含有TTSS(vcsC2)基因,14.10%(21/149)含有SXT毒力基因,2.01%(3/149)含有ST毒力基因,95.97%(143/149)含有rtxA毒力基因,96.64%(144/149)含有mshA毒力基因,89.26%(133/149)含有ISI004毒力基因,93.29%(139/149)含有hlyA毒力基因。外环境水体来源菌株中55.36%(31/56)含有chxA毒力基因,33.93%(19/56)含有TTSS(vcsC2)毒力基因,14.29%(8/56)含有SXT毒力基因,1.79%(1/56)含有ST毒力基因,78.57%(44/56)含有rtxA毒力基因,87.5%(49/56)含有mshA毒力基因,64.29%(36/56)含有ISI004毒力基因,85.71%(48/56)含有hlyA毒力基因。水产品来源菌株中71.43%(10/14)含有chxA毒力基因,57.14%(8/14)含有TTSS(vcsC2)基因,7.14%(1/14)含有SXT毒力基因,7.14%(1/14)含有ST毒力基因,85.71%(12/14)含有rtxA毒力基因,92.86%(13/14)含有mshA毒力基因,85.71%(12/14)含有ISI004毒力基因,100%(14/14)含有hlyA毒力基因。脉冲场凝胶电泳(PFGE)分子分型结果显示,149株病例来源的非01/0139群霍乱弧菌可分成143个PFGE带型,谱型之间的相似度为62.4-100%,不同年份以及不同地区病人来源的菌株并不形成明显的聚类。70株外环境水体和水产品来源的菌株可分成67个PFGE带型,指纹图谱相似度为62.4-100%之间,菌株间无明显的聚类,且不同年份以及不同地区病人来源的菌株也不形成明显的聚类,说明我省非01/0139菌株之间存在着明显的遗传多样性。主要结论1.1985～1989年分离到的非01/0139群霍乱弧菌较多,为病人来源和外环境水体来源,并主要分布在湛江、广州、汕头、海口；1990～1999年,非01/0139群霍乱弧菌菌株数目明显减少,且主要分布在阳江和广州地区；自2001后,非01/0139群霍乱弧菌菌株数目已连续4年呈下降趋势,2007年出现小幅度回升,2012年又有一定的上升,各地区呈散在分布。2.血清型较为分散复杂,分型率达到27.40%,但远低于已发现的200多种非01/0139群霍乱弧菌的血清型范围,因此应加快研发生产更加广泛的非01/0139群霍乱弧菌分型诊断血清,及时发现新的血清型别,提高分型率。3.毒力基因检测发现仅13株非O1/O139群霍乱弧菌菌株含有ctxB毒力基因,经进一步测序后发现均为EL Tor型。毒力基因特征多样,存在ctxB基因缺失,表现为TCP、VSP-Ⅰ/Ⅱ毒力岛基因元件部分阳性,具备此基因特征的菌株一般仅引起散发的腹泻病例,但仍应密切关注此类菌株数量的增加。4. PFGE分型发现菌株间无明显的聚类,且不同年份以及不同地区病人来源的菌株也不形成明显的聚类,说明广东省省非O1/O139菌株之间存在着明显的遗传多样性。