目的Alport综合征(Alport syndrome,AS)是一种进行性遗传性肾炎,常伴有眼和耳部异常,是由Ⅳ型胶原编码基因突变导致的一种基底膜病。Ⅳ型胶原a3-a6链编码基因(Ⅳcollagen gene encoding a3-6 chain,COL4A3-COL4A6)是AS的致病基因,其中编码Ⅳ型胶原a5链的基因COL4A5与性连锁遗传AS(X-linked AS,XLAS)的发生密切相关,而常染色体遗传AS(autosomal recessive inheritance,ARAS;autosomal dominant inheritance,ADAS)则与位于2号常染色体上编码Ⅳ型胶a3、a4链的基因COL4A3、COL4A4有关。在临床上出现血尿的遗传性肾脏疾病中AS较常见,来自美国部分地区的资料显示:AS基因频率大约为1:5000～10000。国外肾活检标本中AS占1.6%～4%,我国的肾活检病理研究报告中0.73%～1.2%的患者被诊断为AS。AS临床表现多样,典型患者具有家族史,表现为血尿、蛋白尿、进行性肾功能不全伴眼耳病变,但相当一部分患者临床表现极不典型,可仅表现为镜下血尿和/或蛋白尿。国内外AS患者的临床特征也有差别,有资料显示,我国AS患者在临床上具有蛋白尿表现较重,耳聋、眼部异常的发生率较高,青少年型较多等特点。因此,应用有效的筛查手段,在我国不同地区开展AS筛查以逐步建立起国内AS患者的临床资料库,具有重要的意义;而进行AS患者基因突变的研究可以在分子水平上了解AS的发病机理、明确AS基因型和临床表型的对应关系,也能为将来开展产前诊断和基因治疗打下基础。本研究我们首先开展AS的临床筛查,对AS确诊和疑诊病例的临床病理特点进行分析,同时总结AS的筛查经验,初步探讨临床上筛查AS的有效手段。并在此基础上展开AS家系的调查,对XLAS家系进行COL4A5基因突变的检测,进一步丰富AS的基因突变库。方法1、选取我科住院患者作为筛查对象,制定筛查患者的入选条件。将肾活检光镜下六胺银染色(PASM)着色异常作为入选条件之一,对重点病例进一步行肾小球基底膜(glomerular basement membrane,GBM)Ⅳ型胶原α链的间接免疫荧光染色(indirect immunofluorescence,iFI)和电镜检查。参考Flinter诊断标准,结合GBMⅣ型胶原α链iFI结果建立AS确诊及疑诊标准,对筛查出的AS确诊及疑诊病例的临床病理特点进行总结分析。2、通过一例AS先证者对其家系展开调查,绘制家系图谱;在22名家系成员中进行临床资料与实验标本的收集。3、酚抽提法提取一XLAS家系中AS先证者及其母亲的外周血白细胞基因组DNA,采用PCR方法扩增COL4A5基因全部51个外显子及其临近的内含子。应用3130 Genetic Analyser测序仪对明确扩增的PCR产物进行直接测序,寻找COL4A5基因突变。结果1、本研究共有108例患者入选进行AS筛查。在108例AS筛查病例中筛查出5例AS确诊病例,占筛查总数的4.6%;4例AS疑诊病例,占筛查总数的3.7%。9例确诊及疑诊病例全部具有血尿家族史,普遍对一般的对症治疗反应差。其中5例确诊病例表现出发病年龄早、肾功能损害重、合并有蛋白尿以及耳聋比例高的临床特点;4例疑诊病例肾功能均正常,3例女性表现为持续性尿检异常。2、行肾活检的7例AS确诊及疑诊病例肾活检病理诊断包括:轻度系膜增生性肾小球肾炎、微小病变及局灶节段硬化,光镜下全部具有PASM着色异常的特点;98例行肾活检的筛查病例中,PASM着色异常者21例。普通免疫荧光多为阴性,GBMⅣ型胶原iFI结果,男患均为阴性,女患α3、α5链呈不连续染色;电镜下确诊及疑诊病例GBM多呈弥漫性厚薄不均改变,2例伴有分层、撕裂,一例女性疑诊病例表现为GBM弥漫性变薄。3、本研究对一例AS先证者进行的家系调查结果显示,该家系中共有10例患者,男性4例,女性6例,分布于四代当中;4例男性患者发病均早,进入终末期肾衰竭(end stage renal disease,ESRD)的时间早,已有3例死于尿毒症;而6例女性患者中仅2例出现肾功能不全,临床症状轻;男性患者不传男,女性患者传男也传女。家系调查还发现,先证者的母亲20岁时即发现双肾缩小,而肾功能长期正常,为临床上少见病例。4、COL4A5基因的测序结果:先证者在COL4A5基因第51外显子的5222位点C碱基被T碱基所替换(C5222T),导致第1674号密码子由精氨酸变成了终止密码子(CGA→UGA,R1674Term);先证者母亲在5222位点表现为T、C碱基杂合。上述结果经重复测序和双向测序得到验证,在正常人的对照中均未发现5222位点存在碱基替换。结论1、本研究所建立的筛查条件能够在临床上进行有效的AS筛查,筛查出的AS确诊和疑诊病例,丰富了本地区AS患者的临床病理资料。2、对于临床上尿检异常的患者,肾活检组织光镜下PASM着色异常这一病理特点在AS的临床筛查中具有重要意义。3、本研究中所调查的AS家系为青少年型XLAS家系;检测到的COL4A5基因第51号外显子5222位点的碱基替换,是引起该家系临床病变的突变位点,为首次报道。