论文部分内容阅读
背景：前列腺癌是男性人群中最常见的肿瘤之一。根据国家癌症中心的最新数据,前列腺癌自2008年起称为泌尿系统中发病率最高的肿瘤,在男性恶性肿瘤发病率排名中居第6位。然而,目前我们对于前列腺癌发生、发展的生物学机制缺乏更为深入的了解。除了常见的流行病学和遗传学因素,许多错综复杂的分子事件是导致肿瘤细胞形成、进展和转移的深层次原因。microRNA(又称为miRNA)是小分子(长度约22nt)的非编码RNA,它在诸多生物信号通路中都具备至关重要的调控作用。异常表达的microRNA常常与肿瘤发生、发展密切相关。已有诸多研究表明前列腺癌与miRNA表达谱异常密切相关。目的：本研究首先利用定量PCR技术考察miR-193a-3p在两种不同的前列腺癌细胞株(DU-145,PC3)中的表达情况,并以细胞功能实验展示了转染miR-193a-3p对前列腺癌细胞中的生物学功能的影响。随后根据生物信息学知识,筛查潜在的miR-193a-3p作用靶点进行验证,最后通过靶基因分子的沉默和过表达实验,证实]miR-193a-3p对靶基因的调控意义。方法：1.比较前列腺癌细胞株(DU-145, PC3)中与正常前列腺上皮细胞(RWPE-1)中miR-193a-3p的表达是否存在差异；2.通过体外转染miR-193a-3p模拟体的方式使细胞进入miR-193a-3p过表达状态,在此基础上,通过细胞活力分析实验(CCK-8)、流式细胞周期检测、平板克隆形成,研究miR-193a-3p与前列腺癌细胞的何种功能有关；3.利用生物信息学工具(TargetScan),预测miR-193a-3p的靶基因。并且通过定量PCR技术,Western Blot技术进行转录水平及翻译水平的验证。与此同时进行荧光素酶双报告系统对miR-193a-3p的作用序列进行进一步的鉴定。以及使用RNA干扰、质粒过表达实验验证miR-193a-3p与靶基因的调控关系。结果：1.在前列腺癌细胞株中,miR-193-3p呈现低表达状态,其中DU-145中miR-193a-3p的含量是RWPE-1的46.3%,在PC3中这个比例是19.0%；2.通过对DU-145及PC3细胞株转染(?)niR-193a-3p模拟体获得miR-193a-3p过表达状态。首先我们可以观察到细胞的活力明显受到了抑制。PC3细胞株中,25nM浓度的mniR-193a-3p转染会使细胞活力下降13%(转染后48小时)和24%(转染后72小时)。DU-145细胞株中25nM的模拟体转染可使细胞活力下降17%(48小时)和63%(72小时)。流式细胞技术显示miR-193a-3p模拟体可显著诱导肿瘤细胞的G1期阻滞。DU-145和PC3的G1期细胞百分比与对照组(NC)相比分别为77.36%对54.89%(p<0.05),81.57%对61.80%(p<0.05)。克隆形成实验中,miR-193a-3p同样会抑制细胞的集落形成。DU-145和PC3细胞株在转染miR-193a-3p后的克隆形成率分别为59.1%(p<0.05)和31.6%(p<0.05)。3.根据生物信息学工具的预测,miR-193a-3p的靶基因可能为Cyclin D1,MMP-9, CADM1等。根据定量PCR的验证结果,Cyclin D1在DU-145及PC3细胞转染miR-193a-3p后出现转录水平明显下调,而MMP-9和CADM-1并未显示出如此趋势。进一步的荧光素酶双报告系统实验确认了Cyclin D1是miR-193a-3p的直接作用靶点。对Cyclin D1的特异性沉默和过表达Rescue实验进一步证实了它在细胞周期及增殖过程中的作用。结论：1.miR-193a-3p在前列腺癌细胞中呈低表达；2.细胞内过表达miR-193a-3p可使前列腺癌细胞DU-145和PC3出现G1期阻滞,抑制细胞增殖；3. Cyclin D1是miR-193a-3p的靶基因,通过抑制Cyclin D1的表达,miR-193a-3p可以将细胞周期阻滞在G1期,进而抑制细胞增殖。