结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤(Extranodal NK/T-cell lymphoma,nasal type)属于非霍奇金淋巴瘤(NHL)的一种少见类型,约占NHL的2%-10%,其在西方人群中非常罕见,但在亚洲、墨西哥和南美洲人群中较为普遍。NK/T细胞淋巴瘤是一个独特的临床病理实体,其发病率居T细胞淋巴瘤的首位,具有侵袭性强、预后不佳的特点,其具体病因和最佳治疗方案到目前为止还尚未搞清楚。所以,进一步研究NK/T细胞淋巴瘤的病因和分子机制有助于评估NKTCL的早期诊断、治疗和预后,也为探索新的治疗靶点提供重要的理论依据。Lumican(LUM)位于人类染色体12q21.3-q22上,其产物基膜聚糖是一种富含亮氨酸的伴有硫酸角质素侧链的原型蛋白多糖,是角质层、皮肤和肌肉结缔组织的主要组成部分。LUM在皮肤、血管、肺、乳腺、胰腺、结直肠、关节软骨等组织中广泛表达。LUM是细胞外基质中的重要组成成分,LUM突变或表达异常或者与整合素相互作用均可以间接地影响肿瘤的转移侵袭,也可以通过参与上皮细胞管样结构的形成调节肿瘤血管的形成,从而影响肿瘤的增殖。有很多研究已证实LUM在消化道肿瘤、呼吸道肿瘤以及泌尿生殖道肿瘤等多种恶性肿瘤中表达异常,其发生突变或者表达异常对肿瘤的发生、发展和转移均可造成一定的影响。LUM在NK/T细胞淋巴瘤中的研究还未见有报道,LUM对NK/T细胞淋巴瘤的发生、发展等生物学作用以及分子机制都有待深入研究。本研究首先通过免疫组化法检测了LUM在结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤以及反应性增生淋巴结中的表达情况,并分析了LUM在NK/T细胞淋巴瘤中的阳性表达与临床病理参数、临床疗效的关系;体外研究,我们利用慢病毒载体构建了LUM过表达载体,经病毒包装并感染NK/T细胞淋巴瘤YTS细胞,得到了稳定过表达YTS-LUM细胞系,并通过细胞生物学和分子生物学方法检测了LUM过表达对NK/T细胞淋巴瘤细胞YTS细胞克隆形成、凋亡、细胞周期、侵袭以及化疗药物敏感性等生物学特性的影响,同时利用Western blot检测了LUM过表达对增殖和凋亡相关蛋白以及NF-κB和JAK/STAT3信号通路相关蛋白表达的影响。最后拟体内研究,我们通过构建肿瘤动物模型,进一步研究了LUM过表达对动物体内NK/T细胞淋巴瘤生长的影响。本研究旨在探索LUM在NK/T细胞淋巴瘤中的生物学功能和分子机制,为NK/T细胞淋巴瘤的临床治疗提供了重要的候选分子标记和靶基因。实验目的:1.检测LUM在结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤以及反应性增生淋巴结组织表达情况,分析其与临床病理参数、疗效之间的关系。2.研究LUM对于NK/T细胞淋巴瘤细胞克隆形成、凋亡、细胞周期、化疗药物敏感性等相关作用,以及对增殖和凋亡相关蛋白以及NF-κB和JAK/STAT3信号通路的影响。3.进一步研究LUM对小鼠移植瘤生长、增殖和凋亡相关蛋白表达以及NF-κB和JAK/STAT3信号通路的影响。主要内容:第一部分:LUM在NK/T细胞淋巴瘤中的表达研究方法1.利用免疫组化方法检测LUM、PCNA在结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤及反应性增生淋巴结中的表达差异。2.分析在NK/T细胞淋巴瘤中LUM阳性表达率与临床病理参数的关系。3.分析在NK/T细胞淋巴瘤中LUM阳性表达率与治疗疗效之间的关系。结果1.免疫组化结果显示LUM在结外鼻型NK/T细胞淋巴瘤组织中阳性表达率(25%)显著低于反应性增生淋巴结(79.2%),P<0.001。2.NK/T细胞淋巴瘤中LUM阳性表达率与患者年龄、性别、发生部位、临床分期、乳酸脱氢酶(LDH)水平均无明显关系(P>0.05)。LUM在PCNA弱表达的患者肿瘤组织中的阳性表达率明显高于PCNA强表达的患者肿瘤组织,即LUM可能与PCNA指数有密切的关系,P<0.05。3.NK/T细胞淋巴瘤中LUM的表达阳性率在有效组(CR+PR)(48.1%)明显高于无效组(SD+PD)(15.6%),P<0.05。第二部分:LUM对YTS细胞生物功能的影响及其分子机制研究方法1.将LUM基因与慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro结合,构建慢病毒过表达载体plenti-LUM,并送公司测序。然后将病毒包装之后感染YTS淋巴瘤细胞,之后进行嘌呤霉素筛选稳定过表达LUM的LUM-YTS细胞。2.用Western blot检测LUM、增殖和凋亡以及NF-κB和JAK/STAT3信号通路相关蛋白的表达量。3.细胞克隆形成实验检测LUM过表达对YTS淋巴瘤细胞克隆形成能力的影响。4.利用CCK-8实验检测LUM过表达对YTS细胞增殖能力的影响5.流式细胞仪检测LUM过表达对YTS细胞周期、细胞凋亡的影响。6.利用Transwell方法检测LUM过表达对YTS细胞侵袭能力的影响。7.CCK-8实验检测LUM过表达对YTS细胞阿霉素敏感性的影响。结果1.pLenti-LUM慢病毒过表达载体菌落PCR和基因测序结果显示,其分子大小及序列与NCBI中的参考序列一致。表明LUM过表达慢病毒载体质粒pLenti-LUM构建成功。2.细胞克隆形成实验和CCK-8实验检测发现LUM过表达显著抑制YTS淋巴瘤细胞克隆形成和增殖能力。3.流式细胞仪检测发现LUM过表达可以明显促进YTS淋巴瘤细胞的凋亡,使细胞G1期阻滞。4.Transwell检测发现LUM过表达可以明显抑制YTS淋巴瘤细胞的侵袭。5.Western blot检测发现LUM过表达能促进促凋亡相关蛋白p53,Bax,caspase-3的表达,抑制抑凋亡因子Bcl-2和增殖相关蛋白CCND1、myc的表达。LUM过表达明显抑制淋巴瘤细胞中NF-κB和JAK/STAT3信号通路相关蛋白NF-κB p65、p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3的表达。6.LUM过表达能够明显增强YTS细胞对化疗药物ADM的敏感性。第三部分:LUM过表达对动物体内NK/T细胞淋巴瘤生长的影响研究方法1.在BABL/nude雌性小鼠(裸鼠)右前肢皮下接种外源肿瘤细胞YTS、YTS-Con和YTS-LUM,构建淋巴瘤动物模型。接种后开始每隔三天测量小鼠移植瘤体积,32天后将移植瘤剥出称重。2.利用Western blot法检测各组小鼠移植瘤中LUM表达情况。3.用Western blot检测各组肿瘤组织中增殖和凋亡相关蛋白、NF-κB和JAK/STAT3信号通路相关蛋白的表达。结果1.对各组YTS荷瘤小鼠的肿瘤重量和体积检测发现,LUM过表达显著抑制肿瘤的生长。2.利用Western blot检测发现,与对照组相比,YTS-LUM组肿瘤组织中LUM蛋白表达显著增加。3.Western blot检测发现,与对照组相比,YTS-LUM组小鼠肿瘤组织中,促凋亡相关蛋白p53,Bax,caspase-3的表达量明显上升,而抑凋亡因子Bcl-2和增殖相关蛋白CCND1、myc的表达量却明显下降。4.与对照组相比,YTS-LUM组移植瘤组织中NF-κB和JAK/STAT3信号通路相关蛋白NF-κB p65、p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3蛋白的表达量明显降低。结论1.LUM在NK/T细胞淋巴瘤中表达量明显降低,且其表达与患者年龄、性别、发生部位、临床分期、乳酸脱氢酶(LDH)水平均无明显关系,与治疗疗效和PCNA指数有密切关系。2.细胞实验表明,LUM过表达可能通过调控NF-κB和JAK/STAT3信号通路,从而抑制淋巴瘤细胞增殖、克隆形成、侵袭,阻滞细胞G1期、促进细胞凋亡、增强细胞对化疗药物阿霉素的敏感性。3.动物体内实验进一步表明,LUM过表达可能通过调控NF-κB和JAK/STAT3信号通路,从而抑制小鼠移植瘤的生长。