血红蛋白类氧载体(hemoglobin-based oxygen carriers，HBOCs)是尚处于不同新药研发阶段的一类新生物制剂药物，可用于代替红细胞的组织供氧作用。目前HBOCs制备所用的血红蛋白主要来源于血库过期人血和牛血，但是人源和牛源生物材料具有一些严重缺点，尤其是具有致命性病原体污染如艾滋病毒、肝病病毒、朊病毒等的威胁，因此探索新的血红蛋白来源对HBOCs产品开发具有十分重要的价值。近年来，我们对猪血红蛋白作为HBOCs基本原料的特点进行了较深入的研究，实验结果表明：猪血红蛋白的氧亲和力与人血红蛋白相似，明显高于牛血红蛋白，且具有较好的化学稳定性，是一种吸引力很强的HBOCs规模生产原料选择的对象。目前，已有数种血液代用品进入临床研究，但是许多产品由于安全性问题而被提前终止。因此，血液代用品的潜在毒性已经成为许多血液代用品进入临床使用的最大障碍。免疫原性和免疫毒性是生物药品尤其是异源蛋白类生物药品研究开发的重要内容，是生物安全性研究的重要组成部分。本文应用猪血为原料制备出高纯度的猪血红蛋白，以戊二醛为交联剂聚合猪血红蛋白制备聚合猪血红蛋白氧载体；通过在不同给药途径和给药条件下反复给动物免疫猪血红蛋白或戊二醛聚合猪血红蛋白，用间接ELISA法检测动物血清中的特异性IgG，研究了猪血红蛋白及其戊二醛聚合体的免疫原性；初步研究了戊二醛聚合猪血红蛋白免疫原性增强的机理；探讨了戊二醛聚合猪血红蛋白在静脉注射条件下无免疫原性的机理；此外本文还进一步研究了戊二醛聚合猪血红蛋白对小鼠抗菌免疫功能及其在体外对小鼠腹腔巨噬细胞系吞噬功能的影响。实验结果表明：猪血红蛋白免疫原性很弱，在无佐剂条件下，经皮下或腹腔免疫途径，在小鼠中反复免疫注射都不能引起特异性抗体(IgG)生成反应。但是，在加福氏佐剂的条件下，猪血红蛋白反复免疫小鼠、兔子或大鼠均能刺激动物产生较高滴度的抗猪血红蛋白IgG。猪血红蛋白的戊二醛聚合产物免疫原性明显增强，在无佐剂条件下，戊二醛聚合猪血红蛋白皮下或腹腔免疫小鼠，均能刺激小鼠产生特异性IgG，戊二醛聚合猪血红蛋白皮下给药与腹腔给药相比对小鼠刺激强度大，抗体产生快，滴度高。但是，静脉注射不同治疗量的戊二醛聚合猪血红蛋白均不能刺激动物产生特异性IgG，进一步研究表明静脉注射治疗量戊二醛聚合猪血红蛋白可引起动物对聚合猪血红蛋白特异性的免疫耐受，动物对其它抗原(如牛血清白蛋白BSA)能够进行正常的免疫应答，而且，免疫耐受的程度与静脉注射的聚合猪血红蛋白呈现明显的剂量依赖关系，静脉注射的聚合猪血红蛋白剂量愈高，诱导的免疫耐受的程度愈强。本文通过对戊二醛聚合猪血红蛋白免疫原性增强机理的初步探讨结果表明：戊二醛聚合兔血红蛋白在加福氏佐剂的条件下，反复皮下免疫兔子均不能刺激兔子产生抗兔血红蛋白特异性IgG。推测原因是：兔子对自身的血红蛋白具有特异性的免疫耐受，戊二醛聚合不能使血红蛋白形成新的抗原决定簇。通过不同分子量聚合猪血红蛋白免疫原性的研究发现：在平均分子量约为67.4KD-147.6kD之间，随着分子量的增大，聚合猪血红蛋白免疫原性增强；在平均分子量为147.6kD-1150KD之间，随着分子量的增大，聚合猪血红蛋白免疫原性逐渐减弱。通过抗人、牛或猪血红蛋白或其相应聚合产物抗体与人、牛或猪血红蛋白或其相应聚合产物抗原抗体交叉反应的比较，结果表明：戊二醛聚合／修饰没有使猪血红蛋白产生新的抗原决定簇；戊二醛不是引起血红蛋白免疫原性增强的原因，动物不能产生抗戊二醛的特异性抗体。因此，我们通过一系列的实验推测：天然未经修饰的猪血红蛋白免疫原性很弱，只有在加佐剂条件下才会产生特异性的免疫反应的原因是：1)动物体包括人体主要通过吞噬细胞代谢体内老化红细胞释放的血红蛋白，血红蛋白被吞噬后大部分被水解，极少部分与MHCⅡ复合体结合，提呈给T细胞，这种代谢途径可能会存在某些漏洞，使极少量的肽段保持完整，与MHCⅡ复合体结合，在免疫系统形成的早期导致免疫系统对同种血红蛋白的免疫耐受；2)动物体的血红蛋白是高度保守的，不同种类的血红蛋白可能具有相同的内涵体或溶酶体蛋白酶裂解位点，因此，不同种类的血红蛋白在吞噬细胞内的裂解方式与动物自身的血红蛋白相同。即大部分的血红蛋白全部被水解。极少部分被提呈给T细胞，因此，只有加佐剂的条件下才能测出血红蛋白的免疫原性；3)佐剂诱导的局部炎症反应能够促进抗原提呈细胞对蛋白的吞噬作用，因此，较大量的异种血红蛋白泄露增加了抗原提呈细胞对异种血红蛋白水解片段的提呈作用，从而引起特异性的免疫反应。戊二醛聚合猪血红蛋白免疫原性增强的原因主要是：1)聚合血红蛋白由于聚合发生局部环境的改变，蛋白酶裂解位点被覆盖而只能被部分水解，在抗原提呈细胞中，蛋白质抗原被部分水解，形成的肽段与MHCⅡ复合体结合从而提呈到细胞表面，从而引起特异性的免疫反应；2)聚合血红蛋白结构更加稳定，在体内代谢时间延长，对淋巴细胞的刺激作用时间延长，从而导致免疫原性增强；3)分子量增大也是聚合猪血红蛋白免疫原性增强的原因。4)如果血红蛋白聚合体太大，血红蛋白剧烈的构像变化会导致血红蛋白分子不能与淋巴细胞的抗原受体发生正常的吻合，或者使血红蛋白分子的特殊化学基团与淋巴细胞表面对应抗原受体相互接触的难度增大，从而使聚合猪血红蛋白的免疫刺激作用减弱。许多研究者报道用HBOCs治疗的病人可能会增加细菌的易感性。本文通过研究在感染细菌的不同时间静脉注射不同剂量的聚合猪血红蛋白研究发现：小鼠在未感染绿脓杆菌之前4、8或20hrs尾静脉注射较高治疗量(130mg／kg)的聚合猪血红蛋白，并不能降低小鼠对细菌的抗感染能力，相反的却能够增强小鼠的抗感染能力。小鼠在感染绿脓杆菌之后或感染的同时静脉注射较高治疗量(130mg／kg体重)的聚合猪血红蛋白，小鼠对细菌的抗感染能力降低，因此，较高治疗量的聚合猪血红蛋白在感染的同时或感染之后使用能够增强细菌的毒性作用。但是，在感染绿脓杆菌的同时注射较低剂量(13或1.3mg／kg体重)的聚合猪血红蛋白不能降低小鼠的抗细菌感染能力，相反的却能够提高小鼠的抗细菌感染能力，其中，1.3mg／kg的促进作用最为显著。病原微生物侵入机体后，在激发免疫应答以前即可被吞噬细胞吞噬并清除，这是机体非特异免疫防御机制的重要环节。本文通过聚合猪血红蛋白在体外对巨噬细胞吞噬绿脓杆菌的影响研究发现：在巨噬细胞和聚合猪血红蛋白共培养0min时感染绿脓杆菌，较高浓度的聚合猪血红蛋白(8或2mg／ml)对巨噬细胞吞噬绿脓杆菌有一定的抑制作用，而低剂量(200、20或2μg／ml)的聚合猪血红蛋白具有促进作用，其中以200μg／ml或20μg／ml的促进作用最为显著；在巨噬细胞和不同浓度的聚合猪血红蛋白(8mg／ml，2mg／ml、200μg／ml、20μg／ml或2μg／ml)共培养2或4小时后感染绿脓杆菌，不同浓度的聚合猪血红蛋白均能够促进巨噬细胞对绿脓杆菌的吞噬作用，其中以200μg／ml的促进作用最为显著。目前，聚合猪血红蛋白促进或抑制吞噬细胞吞噬功能的机理还在进一步的研究中。