前言脑出血(ICH)是神经科的常见病和多发病，其脑损伤的病理生理机制还不十分明确，目前仍没有切实有效的治疗方法，因此临床上脑出血所导致的死亡率和致残率仍很高。脑水肿是脑出血后再损伤，病情恶化的主要原因之一，可通过妨碍脑组织的血供和神经细胞内环境的紊乱等加重神经细胞损伤，严重地影响脑出血的预后。研究发现脑水肿与脑出血本身和血脑屏障(BBB)的破坏有关。血脑屏障紧密连接复合物和星形胶质细胞是保持血脑屏障结构和功能完整性的两个重要因素。七叶皂苷钠(SA)是三萜皂苷的钠盐，是从中国药典收藏的中药婆罗子的干燥成熟果实中提取的。国外由德国药典收藏的生药欧马栗的成熟果实中提取，具有糖皮质激素抗渗出、消肿及对抗磷酸组胺和缓激肽等炎性递质的作用，其作用为氢化可的松的七八倍，而且它还能恢复毛细血管的正常通透性。国内有研究表明：β-七叶皂苷钠注射液(10mg／kg／d)对大鼠急性脊髓损伤有明确的防治作用。本研究旨在通过观察七叶皂苷钠对大鼠脑出血后脑水肿发生时，紧密连接相关蛋白occludin和神经胶质原纤维蛋白(GFAP)阳性细胞的作用，进一步为临床治疗提供可靠的理论依据。材料和方法一、实验材料1．实验动物健康雄性Wistar大鼠72只，体重200-250g之间，购于中国医科大学实验动物中心，所有的实验操作过程完全符合NIH(national institute ofhealth)所规定的标准。2．主要试剂注射用七叶皂苷钠；兔抗大鼠occludin抗体和GAPDH抗体(购于Santa Cruz公司)，GFAP抗体(购于北京中山公司)；免疫组化试剂盒及显色剂(购于武汉博士得公司)；ECL试剂盒(购于美国Sigma Chemical公司)；其余试剂均为国产分析纯。3．主要仪器大鼠脑立体定位仪；微量进样器(50μL)；低温冷冻离心机；透射电镜；紫外分光光度计；自动电泳凝胶成像系统；通用电泳仪；恒温冰冻切片机；Motic Images Advanced 3.2图像分析系统。二、实验方法1．建立大鼠脑出血模型。2．测定大鼠脑组织含水量。3．病理组织学观察(H&E法)。4．脑出血周围组织超微结构观察。5．免疫组化法检测GFAP阳性细胞。6．Western blot法检测occludin的表达。7．图像分析Western blot结果用Chemi Imager 5500 V2.03软件对X光胶片进行扫描，用Fluor Chem 2.0软件测取感光区带的IDV值。免疫组化结果用Motic ImagesAdvanced 3.2图像分析系统采集照片，并进行定量分析。8．统计学分析应用SPSS(statistical package for the social science)统计软件包对数据进行处理。各组实验值以均数±标准差(SD)表示，计量资料两组间与同组间前后比较用Student’s t检验．P＜0.05视为有统计学意义。实验结果一、大鼠脑组织含水量测定模型组大鼠出血同侧脑组织含水量于6h开始明显升高，48h达高峰(平均含水量为83.52％)；出血对侧仅于48h明显升高。给予七叶皂苷钠治疗后，各时间点两侧脑组织含水量均明显下降。二、病理组织学观察光镜下，脑出血后24h血肿周围可见神经元胞体明显肿胀，少量胶质细胞增生，细胞间隙和血管周围间隙增宽；48-72h上述病变加重，并见大量神经元胞核浓缩，胞质红染加深，细胞间隙出现大量空泡，胶质细胞增生活跃。给予治疗后，血肿周围病变明显减轻：24h时血肿周围极少量胶质细胞增生，细胞间隙和血管周围间隙的增宽均不明显；48-72h时，可见增生的胶质细胞增多，神经元胞体肿胀，细胞间隙和血管周围间隙增宽很明显，少量神经元胞核浓缩，胞质稍有红染。三、脑出血周围组织超微结构观察结果假手术组大鼠针孔周围脑组织内血管间的连接无明显改变；模型组大鼠脑出血后48-72h，可见内皮细胞间的紧密连接多处开放；毛细血管基底膜断裂；星形细胞明显肿胀，部分变性、坏死；毛细血管内皮细胞肿胀，呈不规则向管腔突出，管腔变窄。给予七叶皂苷钠治疗后，明显改善。四、GFAP阳性细胞的改变假手术组大鼠针孔周围脑组织仅有少量的GFAP阳性细胞；模型组大鼠脑出血后6h，血肿周围和皮质区GFAP阳性细胞均有明显增多，于48-72h达高峰，且可见胶质细胞明显增生；给予七叶皂苷钠治疗后，各时间点的GFAP阳性细胞均有明显下调。五、血脑屏障紧密连接相关蛋白occludin表达的变化与假手术组比，模型组大鼠血肿周围脑组织在脑出血后6h，occludin表达无明显改变；24h表达量明显减少；48h表达量达最少。给予七叶皂苷钠治疗后，各时间点occludin的表达量均有不同程度的上调。讨论脑出血是一种严重危害人类健康的疾病，脑水肿的发生是引起脑出血病情恶化的主要危险因素。目前认为治疗脑出血的根本问题在于促进脑内血肿的尽快吸收，控制脑水肿和减轻血肿周围继发性神经元的损害，这是脑出血急性期减少病死率、降低致残率的关键环节之一。研究发现脑水肿与脑出血本身和血脑屏障的破坏有关。Occludin(65-80KD)是血脑屏障内皮细胞间紧密连接的相关蛋白，可增加血脑屏障的跨屏障电阻，降低跨细胞途径通透性。Hiais等发现七叶皂苷钠具有促进血肿周围新生血管生长的作用，从而改善微循环，促进血肿周围血流量的恢复，加快血肿的溶解和吸收，这对神经功能的恢复更有意义。本研究发现，大鼠脑出血模型建立后48h，occludin的表达量降至最低，脑水肿极为显著，电镜下可见血脑屏障内皮间的紧密连接多处开放。应用七叶皂苷钠治疗后，occludin的表达量在各时间点均有不同程度的上调，脑水肿明显减轻，血脑屏障内皮间紧密连接的开放有所减少。提示occludin的表达抑制参与脑出血后脑水肿的形成。七叶皂苷钠可能通过减少occludin的表达抑制，减少血脑屏障结构和功能的破坏，进而减少通过血脑屏障进入脑细胞的水分，减轻脑水肿的程度。大脑的微血管系统均由星形胶质细胞终足所包被，这对于血脑屏障完整形态的保持也很有必要。GFAP是星形胶质细胞的特异蛋白和细胞骨架成分之一，其表达的高低反映星形胶质细胞的活化状态。应激反应的星形胶质细胞可以产生多种细胞因子和炎症介质，介导炎性反应，促进内皮细胞的坏死，引起血脑屏障的开放。本研究还发现，模型组血肿周围和皮质区GFAP阳性细胞均有明显增加，且模型建立后48-72h可见阳性细胞增生明显。给予七叶皂苷钠治疗后，各时间点GFAP阳性细胞均明显减少，提示七叶皂苷钠可能通过抑制和(或)延缓星形胶质细胞的过度增生、活化和(或)减少星形胶质细胞增生后释放的某些细胞因子、炎症介质等，减轻脑出血后脑水肿的程度。此外，脑出血后血肿压迫可致局部脑组织缺血、缺氧而产生大量超氧阴离子自由基及羟自由基。自由基可直接造成细胞损伤发生脑水肿，同时引起脑微血管通透性增加，加重脑水肿。自由基拮抗剂可减轻脑水肿，具有神经保护作用。Guillaume等研究发现HCE(其中含70％的七叶皂苷)具有抗自由基作用。提示七叶皂苷钠可能通过清除自由基，来改善出血引起的后续脑损伤的发生，加速脑组织的自身修复。结论1．本研究证实：大鼠脑出血后脑水肿时，出现血肿周围脑组织occludin的表达抑制，提示occludin参与调节血脑屏障功能的稳定性。2．大鼠脑出血后血肿周围GFAP阳性细胞的表达增强，48-72h达高峰，且可见明显的细胞增生。3．七叶皂苷钠可以有效的缓解脑出血后occludin的表达抑制，并减弱GFAP阳性细胞表达增强的趋势，有效地降低了脑出血后脑水肿的程度。