杜仲内生拮抗细菌诱导的玉米植株中抗病基因的筛选与鉴定

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杜仲内生拮抗细菌DZSY21可在玉米中稳定定殖并增强玉米植株的抗病能力。因此,本研究从转录水平上对内生拮抗细菌DZSY21诱导玉米产生抗病性的分子机制进行相关研究,利用转录组测序技术对内生拮抗细菌DZSY21处理玉米后不同生长时间段叶片的TotalmRNA进行差异表达分析,以Fold Change≥2且FDR<0.01为标准,结合差异表达基因注释信息筛选抗病相关差异表达基因(DEGs),并对其进行GO和KEGG注释分析。在此基础上结合抗病基因的特点及差异表达倍数挑选四个抗病相关候选基因并对其进行克隆与功能分析。主要研究结果如下:1.利用Illumina HiSeq测序平台对内生拮抗细菌DZSY21处理的不同处理时间的玉米叶片进行转录组测序,结果显示:以处理0h(T01)作为对照,处理12h(T02)时有2413个差异表达基因,其中上调基因1278个,下调基因1135个;处理24h(T03)时有737个差异表达基因,其中上调基因538个,下调基因199个。在此基础上,根据DEGs功能注释,筛选与抗病相关的差异表达基因,最终获得267个抗病相关基因,其中重叠基因23个。处理第12h筛选得到218个基因,主要涉及脂质转移蛋白(Bifunctional inhibitor/lipid-transfer protein),MATE 转运蛋白(MATE efflux family protein)及 lysM 受体蛋白激酶(LysM domain receptor-like kinase)等 26 个抗病途径;处理第 24h 获得 71 个基因,主要涉及异黄酮还原酶(Isoflavonereductase),纤维素合成酶(Probable cellulose synthase),苯丙氨酸解氨酶(Phenylalanine ammonia-lyase),L-抗坏血酸过氧化物酶(L-ascorbate peroxidase),GLK 转录因子(Probable transcription factor GLK)及ACC氧化酶(ACC oxidase)等30个抗病途径。2.通过对筛选的抗病相关差异表达基因进行GO和KEGG注释等相关分析,结果显示:GO注释中,在生物学过程(biological process)分类中主要聚集在应激反应(response to stimulus),代谢过程(metabolic process)和单一生物过程(single-organism process);在细胞组分(cellular component)分类中主要聚集在细胞器(Organelle),细胞(cell)和细胞部分(cell part);在分子功能(molecular function)分类中主要聚集在核酸结合转录因子活性(nucleic acid binding transcription factor activity),催化活性(catalytic activity)和结合(binding)。KEGG注释中,T01-VS-T02中有30个抗病相关差异表达基因注释到9个代谢通路分支中,T01-VS-T03中有18个抗病相关差异表达基因注释到10个代谢通路分支中。其中主要都是注释到谷胱甘肽代谢(Glutathione metabolism),苯丙氨酸代谢(Phenylalanine metabolism)和苯丙素生物合成(Phenylpropanoid biosynthesis)代谢通路中。3.根据筛选得到的抗病相关差异表达基因(DGEs),结合抗病基因的特点和差异表达倍数挑选 GRMZM2G034611,GRMZM2G455909,GRMZM2G345700,GRMZM2G094490四个抗病相关候选基因。对四个抗病相关候选基因进行载体构建并获得了转基因拟南芥。同时对四个抗病相关候选基因进行生物信息学分析,结果显示:GRMZM2G094490基因与甘蔗的AVY91658.1基因同源关系较近;GRMZM2G455909,GRMZM2G034611 和 GRMZM2G345700 分别与高粱的XP-021316871.1,EES00425.1 和 XP-021318336.1 基因同源关系较近。GRMZM2G094490含有一个外显子;该基因所编码的蛋白含有一个AAA和一个ABC2-membrane结构域。GRMZM2G455909含有一个外显子和两个内含子;该基因所编码的蛋白含有一个Low complexity region和NB-ARC domain。GRMZM2G034611含有两个内含子和一个外显子;该基因所编码的蛋白含有一个 Wall-associated receptor kinase galacturonan-binding 和一个 S-TKc 结构域。GRMZM2G345700含有一个外显子;该基因所编码的蛋白含有一个信号肽、一个 Low complexity region 和一个 AAI domain。对 GRMZM2G094490 基因进行亚细胞定位预测与试验,结果表明:该基因所编码的蛋白定位在细胞膜上。4.利用GRMZM2G034611转基因拟南芥做了相关抗病性试验研究,使用丁香假单胞菌DC3000和水稻细菌性条斑病菌2种病原细菌处理转基因拟南芥,结果显示:GRMZM2G03461 1基因转入拟南芥以后,可增强拟南芥的抗病性,提高其对病原菌丁香假单胞菌DC3000和水稻细菌性条斑病菌2种病原细菌的抗性。
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