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神经胶质瘤是最为常见的脑肿瘤,可根据WHO组织病理学与临床标准分为Ⅰ-Ⅳ级。WHO Ⅳ级是神经胶质母细胞瘤,恶性程度最高,具有很强的侵染性。神经胶质瘤具有高发病率、复发率、死亡率和低治愈率的特点,对其彻底性的手术切除具有极大的难度。目前临床上主要采取手术并辅以放化疗的治疗策略,但治疗效果依旧欠佳。肿瘤的发生与基因突变和代谢紊乱密不可分,对其进行基因治疗具有广阔的发展前景。异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase, IDH)在细胞糖代谢途径中发挥着极为重要的作用。3种异柠檬酸脱氢酶分别为IDH1、IDH2和IDH3,均可催化异柠檬酸盐(isocitrate, ICT)氧化脱羧生成α酮戊二酸(a-ketoglutarate, a-KG)和还原性辅酶II(NADPH)。有文献报道在低级别胶质瘤和继发性胶质母细胞瘤中常有IDH1(R132)的突变,没有IDH1突变的胶质瘤则经常有IDH2(R172)的突变,IDH1和IDH2的突变都是单一位点氨基酸的突变,IDH2的突变频率相对IDH1较低。IDH1和IDH2均在核内编码,以同型二聚体形式发挥作用。IDH1突变后形成的异型二聚体(WT：R132H)明显降低了IDH1的催化活性,导致酶促反应产物α-KG和NADPH的产量也相应下降,同时,突变的IDH1获得了一项新的酶促活性,能够催化α-KG和NADPH生成2-羟基戊二酸(2-hydroxyglutarate,2-HG)。IDH1酶活性的获取与丧失都导致α-KG和NADPH产量的下降。而低氧诱导因子-1(HIF-1)的α亚基(HIF-1α)氧依赖性的泛素化蛋白酶体降解需要α-KG协助,α-KG产量的下降使得HIF-1α稳定性提高,从而使低氧诱导因子-1(HIF-1)转录活性提高,激活葡萄糖载体蛋白1(glucose transporter1, Glutl)和血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)等基因的转录表达,进而促进胶质瘤细胞的增殖。细胞内NADPH水平降低可能会提高胞内氧化性胁迫,从而使得胶质瘤细胞对放化疗的敏感性提高。虽然在各类神经胶质瘤中IDH2突变相对较少,但对IDH2突变的研究是不可被忽视的。实验首先对大鼠神经胶质细胞(C6)的IDH1和IDH2基因序列进行分析,发现C6中IDH1的R132与IDH2的R172位点均未发生突变,说明IDH1与IDH2突变对于亚硝基甲脲诱导产生的大鼠神经胶质瘤C6细胞并不是必需的。随后对C6细胞的IDH2定点突变获得IDH2的常见突变类型R172G,构建得重组质粒pEGFP-N1-IDH2R172G和pEGFP-N1-IDH2,分别转染C6后,激光共聚焦显微镜观察发现,转染后12h异源蛋白逐渐开始表达,24h-36h表达量较高,48h时绿色荧光强度减弱。在IDH2酶活性测定实验中,通过紫外分光光度计检测5min内340nm处的反应体系的吸收值,分析各组NADPH的产量变化情况,结果显示pEGFP-N1-IDH2M组细胞内NADPH产量低于其它两组,pEGFP-N1-IDH2WT组NADPH产量高于pEGFP-N1组,表明IDH2突变后,催化异柠檬酸生成α-KG的活性减弱,但可以催化α-KG生成2-HG,两中反应均导致胞内NADPH水平的下降,而当IDH2wT过量表达时,IDH2的酶量提高,从而使得催化产物NADPH的产量提高。在Western blot实验中,对肿瘤增殖相关因子低氧诱导因子(HIF-1α)、细胞周期蛋白(Cyclin D1)和环氧化酶2(COX-2)进行了检测,发现IDH2突变后,细胞内HIF-1a稳定性提高,Cyclin D1和COX-2的表达量也明显提高。表明IDH2突变后,酶活性下降,其催化产物α-KG量减少后,HIF-1α稳定性提高,进而引起HIF-1α的靶基因Cyclin D1和COX-2表达量提高。在MTT实验检测IDH2突变对C6细胞增殖活力的影响时,发现pEGFP-N1-IDH2M组的抑制率总是低于pEGFP-N1和pEGFP-N1-IDH2W7组,说明IDH2突变后,促进了C6细胞的增殖。利用紫外分光光度计分析细胞内GSH含量时,发现pEGFP-N1-IDH2M组的GSH水平低于pEGFP-N1-IDH2WT组,推测IDH2突变后,催化异柠檬酸生成α-KG的活性减弱,但可以催化α-KG生成2HG,而二者都消耗了胞内的NADPH,使得胞内GSH的量减少,这一结果可能会提高细胞内氧化性协迫,从而使得胶质瘤细胞对放化疗的敏感性提高。在检测IDH2突变后C6对化疗药物敏感性变化的实验中,发现不同药物浓度处理C6细胞时,pEGFP-N1-IDH2M组的仰制率总是高于其它两组,并且这一现象对所选用的5种药物处理情况下普遍存在,推测野生型的1DH2过表达后,IDH2酶量提告，致使催化产物α-KG水平上升,最终导致HIF-1α稳定性降低,抑制肿瘤细胞的生长。当IDH2突变后,酶活性降低,细胞内α-KG水平降低导致HIF-1α稳定性提高促进细胞生长的同时,新的酶活性又进一步降低了细胞内NADPH的水平,导致细胞内还原型谷胱甘肽(GSH)和硫氧还蛋白的减少,从而使得肿瘤瘤细胞C6对化疗的敏感性提高,在这两条路径共同作用下最终导致药物对pEGFP-N1-IDH2M组的抑制率总足低于pEGFP-N1-IDH2WT组。本实验对IDH2突变后其酶活性变化和IDH2突变对C6细胞活力及肿瘤增殖相关因子的影响进行了分析,并对其导致的神经胶质瘤细胞对化疗的敏感性相关机制进行了探讨,不仅有助于理解肿瘤发生与发展的生物学机制,也有助于识别新的抗癌药物的靶标和新的癌症防治手段。