不孕症(infertility)正在成为一个覆盖于全球各个国家和地区的健康问题。据统计,约有10%-15%育龄夫妇受到其影响。当今社会,人们工作和生活压力的日益沉重,生育年龄的不断延后,再加上饮食习惯的改变和生态环境的恶化,致使生育能力下降的原因变得越来越复杂。体外受精-胚胎植入(in-vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)技术作为新的科技手段为很多有生育诉求的不孕症夫妇带来了生育的可能性,因此在世界范围内应用越来越广泛。目前普遍认为IVF-ET技术依靠诱导排卵,体外受精和胚胎移植,能够帮助因女方排卵困难,输卵管因素,以及男方弱精少精等导致不孕症的夫妇,而对于由子宫内膜因素造成植入失败、反复流产的患者应用有限。IVF-ET技术的平均胚胎植入成功率仅为25%左右,且30年来这一数据始终未取得显著改善。子宫内膜容受性的降低被认为需对约2/3的植入失败事件负责。正常妊娠过程中,胚胎的发育和子宫内膜容受性的发展二者相互独立,而又按时协同发育以完成植入。子宫内膜容受性的建立有赖于卵巢性激素及多种相关因子的共同作用,从而使子宫内膜在形态和生化方面发生重塑性变化,变为允许胚胎植入的状态。这些重塑性变化主要表现为子宫内膜腺上皮细胞(Endometrial epithelium cells,EEC)分泌功能改变、子宫内膜间质细胞(Endometrial stromal cells,ESC)分化为蜕膜样细胞、淋巴细胞募集、细胞外基质重建和血管增生重构等。其中,间质细胞在激素作用下分化为蜕膜样细胞,发生一系列形态和功能改变的过程称为蜕膜化(Decidualization)。蜕膜化过程障碍是子宫内膜容受性低下的最主要原因。发生蜕膜化的间质细胞由细长的成纤维样逐渐变为大而圆的多边形,细胞核增大,核仁复杂程度增加,胞质内分泌样物质增多,呈现典型的蜕膜样变化:同时多种蜕膜化标志性蛋白的合成增加,如胰岛素样生长因子结合蛋白-1(Insulin-like growth factor-binding protein 1,IGFBP-1)和催乳素(Prolactin,PRL)等。研究者们通过将原代子宫内膜间质细胞与醋酸甲经基孕酮(Medroxyprogesterone acetate,MPA)和 8-溴腺苷-3’,5’-环单磷酸(8-bromoadenosinecAMP,8-Br-cAMP)体外共培养诱导体外蜕膜化。诱导蜕膜化的间质细胞与自然发生蜕膜化的间质细胞在形态上差别很小,相关基因表达也基本一致,可作为体外研究蜕膜化过程的良好模型。蜕膜化过程主要受卵巢性激素的调控,此外还有多种信号转导因子、细胞因子、转录因子及某些免疫细胞参与其中,其调节机制是一个复杂而又精密的调控网络,涉及一系列的生物学事件和多条调控通路。蛋白激酶B(Protein kinase B,AKT)是经典细胞信号通路PI3K-AKT-mTOR中的一个关键激酶。AKT可以在上游的信号作用下发生磷酸化,活化后的AKT能够激活细胞内的多种酶、转录因子等,进而发挥对细胞的生物学功能的调控作用。该信号通路是细胞内较为经典的信号通路,在体内各种组织细胞中均有涉及,更是参与了能量代谢、细胞增殖凋亡、细胞周期调控、蛋白质合成等多项重要生命活动。AKT通路与蜕膜化过程也有紧密的联系。在体外体内实验中,均能观察到蜕膜化过程中AKT磷酸化水平的明显降低,同时在多种影响子宫内膜容受性的内膜疾病中存在AKT磷酸化水平异常升高的现象。有研究证实AKT磷酸化水平下调,能够直接导致其下游产物FOXO1A蛋白水平升高,促进蜕膜化标志物基因IGFBP-1和PRL的表达,同时诱导细胞周期停滞,抑制增殖,促进分化,推进蜕膜化过程的发展。然而,现有的研究尚未阐明蜕膜化过程中导致AKT磷酸化水平降低的上游机制。5lkDsFK506 结合蛋白(FK-506-bindingprotein,FKBP51)属于 FKBPs 蛋白家族,该家族蛋白因其具有与免疫抑制剂FK506结合的能力得名。FKBP51具有多种生物学功能,参与微管形成,肿瘤调控,精神应激,细胞自噬以及类固醇激素受体活性调节等生理病理过程。国内外的研究发现在多种细胞系中,FKBP51的表达水平能够在孕激素和雄激素的作用下迅速上调,同时,FKBP51还能与Hsp90结合,参与构成类固醇受体复合物从而调节受体活性。FKBP51还可以作为桥联蛋白联系 AKT 与 PHLPP(PH domain and leucine rich repeat protein phosphatase),促使两者在空间上靠近导致AKT Ser473位点发生特异性去磷酸化。卵巢性激素的作用和AKT信号通路调节都是蜕膜化过程的重要调控机制,亲免素FKBP51与二者均有紧密的联系,因此我们猜测FKBP51可能在蜕膜化过程有着重要的调节作用。研究目的明确FKBP51是否是蜕膜化过程的重要调节蛋白,探讨其对蜕膜化过程调节作用的机制。研究FKBP51表达与AKT信号通路在蜕膜化过程中的相互作用及其机制。研究方法1通过免疫组化技术检测组织芯片上正常子宫内膜组织中FKBP51蛋白的表达情况,按月经周期的不同分期以及内膜细胞的类型分组,比较各分组间FKBP51表达水平的差异。2建立小鼠早期妊娠模型,通过免疫组化技术检测在小鼠早期妊娠过程中FKBP51表达水平的变化趋势。3收集来自山东大学附属生殖医院的子宫内膜组织共27例,收集对象平均年龄31.4岁,具有规律的月经周期,性激素水平在正常参考范围内,营养状态正常。按照文献描述的方法获取子宫内膜原代细胞,并应用免疫组化技术和Western blotting技术评价获取原代细胞的纯度。4将原代细胞与含有MPA和8-Br-cAMP的培养基共培养4天,以构建体外蜕膜化模型。利用相差显微镜观察细胞蜕膜化后的形态变化,利用CCK8试剂盒和流式细胞术检测蜕膜化过程中细胞增殖能力变化和周期变化,利用Western blotting技术、RT-PCR技术检测细胞中蜕膜化相关蛋白表达水平的改变。5使用FKBP51下调慢病毒转染子宫内膜间质细胞,观察其对子宫内膜间质细胞蜕膜化的影响。利用荧光显微镜和流式细胞术观察转染效率,利用Western blotting技术观察转染效果以及对细胞内蛋白表达水平的影响。并观察细胞形态变化,增殖能力变化和细胞周期分布变化。6使用FKBP51-cDNA质粒瞬时转染子宫内膜间质细胞FKBP51下调稳转细胞系,观察其对子宫内膜间质细胞蜕膜化的影响。利用Western blotting技术观察对细胞内蛋白表达水平的影响,并观察细胞增殖能力变化。7使用FKBP51 cDNA转染子宫内膜腺上皮细胞,通过胚球植入模型观察FKBP51过表达对腺上皮植入能力的影响。8使用AKT激动剂SC79上调间质细胞内AKT磷酸化水平,通过CCK8试剂盒和流式细胞术检测细胞增殖能力变化和周期变化;利用Western blotting技术检测细胞中蜕膜化相关蛋白以及AKT通路蛋白表达水平的改变,观察AKT磷酸化水平上调对子宫内膜间质细胞蜕膜化的影响。9使用AKT激动剂SC79刺激FKBP51过表达稳转的子宫内膜间质细胞,观察其对子宫内膜间质细胞蜕膜化的影响。利用Western blotting技术观察对细胞内蛋白表达水平的影响,并观察细胞增殖能力变化。实验结果1 FKBP51在人体和小鼠体内蜕膜化过程中表达水平升高人子宫内膜组织芯片染色结果显示:在子宫内膜间质细胞中,FKBP51的表达水平在不同年龄段中的差异没有统计学意义(P= 0.483),而其表达水平在月经周期分泌期显著高于增殖期(P = 0.000);在子宫内膜腺上皮细胞中,FKBP51的表达水平在不同年龄段中的差异没有统计学意义(P = 0.515),其表达水平在月经周期的分泌期和增殖期中也没有显著差异(P= 0.521)。小鼠早期妊娠模型中,受精后第1日,FKBP51表达水平很低;受精后第5日为胚胎植入日,蜕膜化过程基本完成,此时FKBP51表达水平显著升高;从受精后第8日到第11日,随着蜕膜化反应消退,间质细胞中FKBP51表达水平逐渐降低。2间质细胞体外蜕膜化模型中,FKBP51表达水平升高与蜕膜化进展同步用含有MPA和8-Br-cAMP的培养基培养子宫内膜间质细胞,可成功诱导其在体外发生蜕膜化。可观察到间质细胞细胞形态出现典型的蜕膜化变化。同时在间质细胞蜕膜化过程中,间质细胞增殖能力降低,细胞周期停滞于G0/G1和S期。间质细胞蜕膜化过程中,FKBP51表达水平逐渐增高,与蜕膜化标志性蛋白表达水平的升高在时间上具有一致性。3孕激素诱导间质细胞FKBP51表达水平升高孕激素能够诱导间质细胞中FKBP51表达水平的升高,且这种诱导作用存在孕激素剂量依赖性,而加入RU486阻断孕激素的作用后,FKBP51表达水平的升高和IGFBP-1的合成均受抑制(P<0.05)。4 FKBP51表达水平下调抑制间质细胞蜕膜化使用下调FKBP51表达水平的shRNA慢病毒转染原代子宫内膜间质细胞,可以观察到蜕膜化过程受到抑制:间质细胞蜕膜化典型的形态改变消失,蜕膜化对间质细胞增殖能力和细胞周期的抑制作用消失,同时蜕膜化过程的两个经典标志性蛋白,IGFBP-1和PRL的表达水平也受到抑制。回复实验中,FKBP51cDNA转染纠正了 shRNA造成的蜕膜化抑制。5 FKBP51不影响腺上皮细胞植入功能将FKBP51 cDNA瞬时转染入腺上皮细胞后,我们通过胚球植入模型检测了腺上皮细胞粘附胚球能力的改变。结果显示转染FKBP51 cDNA的腺上皮细胞和转染空载质粒的腺上皮细胞植入功能没有明显的差异(P=0.083)。说明FKBP51不影响腺上皮细胞的植入功能。6 AKT Ser473位点磷酸化水平在蜕膜化中降低在MPA+cAMP刺激后,子宫内膜间质细胞和腺上皮细胞中,AKTSer473位点的磷酸化水平均明显降低,而Thr308位点的磷酸化水平则变化不明显,同时与蜕膜化相关的Ser 473位点的下游蛋白FOXO1A表现为随蜕膜化进程的发展而逐渐增加的趋势(P<0.05)。说明AKT通过Ser473位点磷酸化水平的降低参与蜕膜化调控。7 AKT Ser473位点磷酸化水平升高抑制蜕膜化以不同浓度SC79刺激间质细胞后,用MPA和8-Br-cAMP诱导蜕膜化。结果显示在SC79的作用下,蜕膜化中AKT Ser 473位点的磷酸化水平较无SC79处理组明显升高(P<0.05)。在SC79处理组中,作为蜕膜化标志性蛋白的IGFBP-1和PRL在MPA+cAMP诱导后,与对照组相比显著受到抑制(P<0.05)。SC79造成的Ser473位点AKT磷酸化水平升高抑制间质细胞蜕膜化。8 FKBP51抑制AKT Ser473位点磷酸化向间质细胞中分别转染FKBP51上调和下调慢病毒后对细胞中蛋白表达分析显示,FKBP51表达水平下调导致AKTSer473位点磷酸化水平的升高,同时导致下游FOXO1A蛋白降解;而FKBP51表达水平上调能够显著抑制AKT S473位点的磷酸化水平,并导致下游FOXO1A蛋白水平增加(P<0.05)。9 FKBP51通过调节AKT磷酸化水平调控蜕膜化SC79对蜕膜化过程的抑制作用能够被FKBP51的过表达被纠正。SC79显著升高AKTSer473位点磷酸化水平,抑制蜕膜化标志性蛋白的合成;而在FKBP51过表达的细胞中,由于FKBP51的过表达抑制AKTS473位点的磷酸化,SC79对AKT磷酸化水平的升高作用不再显著,对蜕膜化标志性蛋白合成的抑制作用消失(P<0.05)。SC79会导致MPA+cAMP对间质细胞增殖能力抑制作用的消失;但FKBP51过表达则能够使MPA+cAMP的抑制作用再次出现。说明在子宫内膜蜕膜化过程中,FKBP51表达水平的改变通过调节AKT Ser473位点的磷酸化水平调控蜕膜化过程。结论FKBP51蛋白是蜕膜化调控的重要蛋白。蜕膜化过程中,孕激素诱导间质细胞中FKBP51表达水平升高,从而抑制AKT Ser473位点磷酸化水平,减少FOXO1A的降解,促进蜕膜化标志性蛋白IGFBP-1和PRL的分泌,抑制间质细胞增殖,促进细胞分化,促进蜕膜化的进展。