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在重-极重度听力损失患者中，GJB2和SLC26A4是最常见的两个致病基因。常染色体隐性遗传NSHI患者中，约有50％为GJB2基因突变引起。本实验室于飞博士针对GJB2基因在全国范围内开展了大规模的分子流行病学研究，明确了中国耳聋人群GJB2基因突变所致耳聋比例为14.96％，另外还有6.05％的比例可能为GJB2相关性耳聋(携带单个GJB2基因已知致病突变)；绘制了中国NSHI人群GJB2基因的突变图谱。而SLC26A4基因突变情况在全国还没有类似GJB2基因的大规模的研究，对SLC26A4基因突变筛查与鉴定，无疑将给遗传咨询带来很大帮助。GJB2基因蛋白的编码序列仅存在于一个外显子，因此很容易通过PCR反应和直接测序进行分析，SLC26A4基因含有21个外显子，突变表现为广泛的等位基因异质性，目前报道的SLC26A4基因突变类型已达150余种，除外显子20外，其他20个外显子均有突变位点分布。虽然直接测序敏感度最高且是突变检测的金标准，但不适合大规模高通量的突变筛查。近年来发展起来的一项新的突变检测技术，变性高效液相色谱(denaturing high performance liquid chromatography，DHPLC)技术是一项高通量、经济、敏感、特异的筛查技术，为解决这一问题提供了可能。本研究利用解放军总医院耳鼻咽喉研究所建立的聋病遗传资源收集系统，收集大量重-极重度听力损失耳聋患者资料，应用本实验室WAVE-99-3500HT DHPLC分析仪进行SLC26A4基因的分子流行病学研究工作，本研究包括以下三个部分：第一部分重-极重度耳聋患者临床资料的收集和应用DHPLC技术筛查SLC26A4基因突变方法的建立本部分的研究目的是初步建立DHPLC技术用以筛查SLC26A4基因已知突变。首先扩增PCR：8LC26A4基因共有21个外显子，外显子1位于非编码区，故未针对此外显子设计引物；采用美国哈佛大学波士顿儿童医院遗传诊断实验室吴柏林教授提供的针对每个外显子及其侧翼序列而设计的引物17对，外显子11和外显子12共用一对引物；外显子7、8的引物序列是参考Coyle等的文献设计。然后确定检测条件：采用实验室经过直接测序确定的带有已知突变的DNA标本为阳性对照标本，野生型DNA标本为阴性对照标本；在WAVE-99-3500HT DHPLC分析仪自带的Navigator软件给出的推荐检测温度基础上，根据经验最后确定出针对SLC26A4基因20个外显子扩增的19个片段的最佳检测条件，所得出的阳性和阴性样本的色谱图区分非常明确、直观。第二部分DHPLC筛查SLC26A4基因突变方法的双盲法验证本部分的研究目的是采用双盲法进一步验证第一部分实验确定的DHPLC检测条件下筛查SLC26A4基因突变的敏感性和特异性。选取本实验室从全国19个省市地区聋校收集的1552例重-极重度聋儿中经直接测序外显子7+8扩增片段筛查出IVS7-2A＞G单杂合突变的病例共100个作为研究对象；两位实验者分别同时对100个聋儿的其他17个外显子进行DHPLC和直接测序的双盲法筛查。结果显示通过测序方法检测出的突变，用DHPLC同样可以检出，更重要的是筛查出25种新突变；灵敏度达到100％；特异性可达到89％，这与国际上报道的灵敏度和特异性可达96-100％基本一致。通过本部分的研究我们确立了应用DHPLC技术筛查SLC26A4基因的检测方法。第三部分应用DHPLC技术筛查重-极重度耳聋患者患者SLC26A4基因突变本部分的研究目的是应用DHPLC技术对全国26个省市2217名重-极重度患者进行SLC26A4基因突变的筛查。总体技术路线为：提取DNA，进行PCR扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测PCR的含量，样本随机两两相混变性复性后经DHPLC分析，判断出的阳性或异常样本经直接测序最终确定突变有无和突变类型。通过本部分的实验我们进一步确定了DHPLC技术的高灵敏度和特异性，同时证明在优化的PCR条件下DHPLC技术在单一温度条件下可检测出同一外显子多种不同位点的突变；SLC26A4基因在中国耳聋人群中的携带率至少为14.87％；本研究中共发现74种突变(包括第一部分的阳性对照样本的突变类型)，其中54种为国际上尚未报道的新突变，20种曾经报道的突变。这些突变位点遍布于除外显子1的其他20个外显子，充分显示SLC26A4基因突变的广泛异质性，其中较易突变的区域包括外显子7+8、19、10、17和15。突变携带率分别为3.34％、1.85％、1.48％、0.74％。位于外显子8侧翼序列的IVS7-2A＞G是中国耳聋人群特异常见的突变位点，占75.9％；其次为外显子19上的H723R，约占14.93％。再后依次为N392Y占2.35％；1229C＞T占2.13％。本研究建立了DHPLC技术筛查SLC26A4基因突变的方法，应用此快速准确的分子诊断方法结合直接测序明确了中国耳聋人群SLC26A4基因的突变频率；绘制了中国重-极重度耳聋人群SLC26A4基因的突变图谱；为我国建立聋病的产前基因诊断、遗传筛查和遗传咨询提供实验证据，为耳聋基因诊断在全国范围开展提供流行病学数据。