目的:阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是老年人群高发的难治性神经退行性疾病,目前治疗药物主要是乙酰胆碱酯酶抑制剂(Acetylcholinesterase Inhibitors,AChEIs)和N-甲基-D-天冬氨酸受体(N-Methyl-D-Aspartate Receptors,NMDARs)拮抗剂,但效果有限。研究报道黄酮类化合物其具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤和植物雌激素样作用等,并对神经退行性疾病具有神经保护作用。本研究选取15种中草药来源的黄酮类化合物,通过不同的细胞模型筛选出对体外模型均具有较好保护作用的化合物,并进一步研究其保护机制。期望对AD等神经退行性疾病的治疗药物的研究提供提供新的实验依据。本研究使用的15种黄酮类化合物包括,7种双氢黄酮:球松素(Pinostrobin,PIN),2S-柚皮素((2S)-Naringenin,2S-NAR),(±)-柚皮素((±)-Naringenin,NAR),7-甲氧基黄烷酮(7-methoxy-dihydroflavone,7MF),2S-山姜素((2S)-Alpinetin,ALP),二氢杨梅素(Ampelopsin,AMP),甘草素(Liquiritigenin,LIQ);3种黄酮:杨梅素(Myricetin,MYR),高良姜素(Galangin,GAL),汉黄芩素(Wogonin,WOG);4种异黄酮:染料木素(Genistein,GEN),大豆甙元(Daidzein,DAI),黄豆黄素(Glycitein,GLY1),黄豆黄苷(Glycitin,GLY2);1种双氢异黄酮:二氢大豆苷元(Dihydrodaidzein,DDAI)。方法:1.用谷氨酸诱导具有神经表型的高分化PC12细胞建立神经元兴奋性损伤模型。(1)不同浓度的黄酮类化合物样品作用于正常PC12细胞24 h,用CCK-8法检测各黄酮类化合物对于正常PC12细胞的细胞毒性作用。(2)不同浓度的黄酮类化合物作用于正常PC12细胞6 h,再与2 mM的谷氨酸共孵育24 h,用CCK-8法检测各黄酮类化合物对于谷氨酸损伤PC12细胞的作用。从而筛选出对此模型具有保护作用的黄酮类化合物。2.用细菌脂多糖(LPS)刺激BV2小胶质细胞引起炎症反应,建立小胶质细胞炎症活化的体外细胞模型。不同浓度的黄酮类化合物与BV2细胞预孵育30 min,再经LPS 100 ng/mL刺激24 h后收集细胞上清,ELISA检测各黄酮类化合物对BV2细胞释放的炎症因子TNF-α和IL-6的影响。3.7MF体内外实验的抗神经炎症作用研究。(1)用LPS刺激BV2小胶质细胞引起炎症反应,建立小胶质细胞炎症活化的体外细胞模型。实验分为空白对照组,LPS 100 ng/mL刺激组,LPS刺激+7MF 10、20、40μM组。7MF与BV2细胞预孵育30 min,再经LPS 100 ng/mL刺激24 h后收集细胞样品进行检测。用qRT-PCR法检测TNF-α和IL-6 mRNA的水平,Western Blot方法检测iNOS、COX2、MCP-1、ICAM-1、TLR4、MyD88、p-p38、p38、p-ERK、ERK、p-JNK、JNK的蛋白表达水平,用DCF-DA试剂检测活性氧在细胞内的表达。并用免疫荧光法进行定位检测LPS与其膜受体的结合情况。给予7MF 5、10、20、40μM的剂量刺激BV2小胶质细胞24 h,Western Blot方法检测Nrf2、HO-1、NQO-1、p-AMPK、AMPK、p-LKB1的蛋白表达水平。(2)用LPS刺激N9小胶质细胞引起炎症反应,建立小胶质细胞炎症活化的另一种体外细胞模型。实验分为空白对照组,LPS 100 ng/mL刺激组,LPS刺激+7MF 10、20、40μM组。7MF与N9细胞预孵育30 min,再经LPS 100 ng/mL刺激24 h后收集细胞样品进行检测。Western Blot方法检测MAPK信号通路中p-p38、p38、p-ERK、ERK、p-JNK、JNK的蛋白表达水平。(3)C57BL/6J小鼠腹腔注射LPS诱导小鼠的神经炎症模型。实验分为空白对照组,LPS模型组,7MF 10 mg/kg组,7MF 20 mg/kg组,7MF 40 mg/kg组。先给予7MF保护治疗3天,再进行LPS腹腔注射造模,造模24 h后进行动物组织取材。用ELISA检测外周血中IL-6的含量,免疫组化法检测小胶质细胞(Iba-1标记)和星形胶质细胞(GFAP标记)在脑内的活化情况,Western Blot方法检测p-AMPK、AMPK、p-LKB1、p-CaMKⅡ在海马组织中的蛋白表达水平。4.PIN体内外实验的抗神经炎症作用研究。(1)用LPS刺激BV2小胶质细胞引起炎症反应,建立小胶质细胞炎症活化的体外细胞模型。实验分为空白对照组,LPS 100 ng/mL刺激组,LPS刺激+PIN 10、20、40μM组。PIN与BV2细胞预孵育30 min,再经LPS 100 ng/mL刺激24 h后收集细胞样品进行检测。用qRT-PCR法检测TNF-α和IL-6 mRNA的表达,Western Blot方法检测COX2、p-p38、p38、p-ERK、ERK、p-JNK、JNK的蛋白表达水平,用DCF-DA检测活性氧在细胞内的表达。并用免疫荧光法进行定位检测LPS与其膜受体的结合情况。给予PIN 5、10、20、40μM的剂量刺激BV2小胶质细胞24 h,Western Blot方法检测Nrf2、HO-1、NQO-1的蛋白表达水平。(2)C57BL/6J小鼠腹腔注射LPS诱导小鼠的神经炎症模型。实验分为空白对照组,LPS模型组,PIN 10 mg/kg组,PIN 20 mg/kg组,PIN 40 mg/kg组。先给予PIN保护治疗3天,在进行LPS腹腔注射造模,造模24 h后进行动物组织取材。用ELISA检测外周血中IL-6的含量,免疫组化法检测小胶质细胞(Iba-1标记)和星形胶质细胞(GFAP标记)在脑内的活化情况。结果:1.15种黄酮类样品对正常PC12细胞生长具有促进作用的化合物是LIQ,对正常PC12细胞生长具有细胞毒性作用的化合物是2S-NAR、MYR、GAL、WOG和GEN,对谷氨酸损伤的PC12细胞具有保护作用的化合物是PIN、2S-NAR、NAR、7MF、ALP、LIQ、GAL、WOG和DDAI,促进谷氨酸损伤PC12细胞的化合物是AMP、MYR、GLY1和GLY2。2S-NAR、GAL和WOG的有效保护剂量也是作用于正常PC12细胞的有毒剂量,PIN和7MF在高剂量80μM浓度下对PC12细胞有细胞毒性作用。2.15种黄酮类样品对LPS刺激引起的TNF-α和IL-6含量的增加均有一定的抑制作用。其中,对TNF-α和IL-6表达均有显著抑制作用且作用效果呈剂量依赖性增强的化合物是PIN、2S-NAR、7MF、LIQ、GAL、GEN和DAI;对TNF-α和(或)IL-6表达均有显著抑制作用但作用效果无剂量依赖性的化合物是NAR、MYR、WOG、GLY2和DDAI;ALP和AMP对IL-6的表达无剂量依赖性,且ALP、AMP和GLY1对TNF-α的表达有随浓度增加抑制作用减弱的趋势。3.7MF的体内外实验均提示具有抗神经炎症的作用。(1)LPS刺激BV2小胶质细胞激活TLR4/MyD88/MAPK信号通路,并增加炎症调节酶iNOS和COX2、趋化因子MCP-1和黏附分子ICAM-1的蛋白表达。本实验发现,7MF能够抑制TNF-α和IL-6蛋白和mRNA的表达,抑制iNOS、COX2、MCP-1和ICAM-1的蛋白表达,并降低细胞内活性氧的水平。7MF抑制LPS与膜受体结合,并抑制TLR4和MyD88的蛋白表达。LPS刺激BV2小胶质细胞使MAPK信号通路中的关键蛋白p38和JNK磷酸化激活,7MF能够降低JNK的磷酸化水平,但对p-p38的激活没有明显作用。Nrf2是氧化还原反应的转录因子,可激活下游的抗氧化基因HO-1和NQO-1而抑制炎症反应,AMPK可促进Nrf2的抗氧化作用。本实验发现,7MF激活Nrf2而增加HO-1和NQO-1的表达,并促进BV2小胶质细胞p-AMPK和p-LKB1的蛋白表达。(2)LPS刺激N9小胶质细胞激活MAPK信号通路。本实验发现,LPS刺激N9小胶质细胞使MAPK信号通路中的关键蛋白p38、ERK和JNK磷酸化激活,7MF能够降低ERK和JNK的磷酸化水平,但对p-p38的激活没有明显作用。(3)LPS腹腔注射可引起小鼠的神经炎症反应,激活参与神经炎症反应的小胶质细胞和星形胶质细胞,抑制磷酸化AMPK和CaMKⅡ的表达。本实验发现,7MF可抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的激活,并减少外周血中IL-6的释放。7MF可促进p-AMPK和p-CaMKⅡ在海马中的表达,但对p-LKB1的表达没有明显作用。4.PIN的体内外实验均提示具有抗神经炎症的作用。(1)LPS刺激BV2小胶质细胞激活MAPK信号通路,并增加炎症调节酶COX2的蛋白表达。本实验发现,PIN能够抑制TNF-α和IL-6蛋白和mRNA的表达,抑制COX2的蛋白表达,并降低细胞内活性氧的水平,抑制LPS与膜受体结合。LPS刺激BV2小胶质细胞使MAPK信号通路中的关键蛋白p38和JNK磷酸化激活,PIN能够降低JNK的磷酸化水平,但对p-p38的激活没有明显作用。Nrf2可激活下游的抗氧化基因HO-1和NQO-1而抑制炎症反应。本实验发现,PIN激活Nrf2而增加HO-1和NQO-1的表达。(2)LPS腹腔注射可引起小鼠的神经炎症反应,激活参与神经炎症反应的小胶质细胞和星形胶质细胞。本实验发现,PIN可抑制小胶质细胞和星形胶质细胞的激活,并减少外周血中IL-6的释放。结论:1.PIN、7MF和LIQ在谷氨酸诱导的神经损伤模型和LPS诱导的神经炎症模型中均具有神经保护作用。2.本研究首次发现7MF具有神经保护作用,其抗神经炎症的作用机制是抑制TLR4/MyD88/MAPK信号通路和激活AMPK/Nrf2信号通路。并能抑制脑内小胶质细胞和星形胶质细胞的激活,提示体内有效。3.PIN具有抗神经炎症作用,其作用机制是抑制MAPK信号通路和激活Nrf2信号通路。并能抑制脑内小胶质细胞和星形胶质细胞的激活,提示体内有效。上述研究结果提示,7MF通过抗神经炎症在神经退行性疾病中具有潜在的应用价值和广阔的应用前景。