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研究背景:人牙周膜干细胞(h PDLSCs)是牙周组织再生中最适宜的种子细胞之一。在组织工程中,除适宜的种子细胞以外,生物材料也是必不可少的组成部分。良好的生物材料可以在体外扩增或体内移植种子细胞时与其协作,发挥积极作用。来源于间充质干细胞(MSCs)的细胞外基质(ECM)最近被证明是培养MSCs的理想表面材料。人尿源性干细胞(h USCs)具有易收集、采集非侵入性、价格低廉等优点,使它成为产生干细胞外基质的合适来源。本研究的目的为探究h USCs来源ECM(UECM)的生物学特点,以及对于h PDLSCs增殖、粘附、铺展和分化的作用。材料和方法:体外实验:从健康成年男性(年龄:20-25岁之间)尿液中提取h USCs。从正畸患者(年龄:12-18岁之间)中收集因为正畸治疗而拔除的健康前磨牙用于提取h PDLSCs。流式细胞仪检测两种干细胞的细胞表面标志物并进行多向分化能力鉴定。第4代h USCs和h PDLSCs接种于空白塑料孔板(TCP),刺激产生细胞外基质。8天后脱细胞处理,只留下ECM。利用免疫荧光和扫描电镜检测人尿源性干细胞外基质(UECM)的蛋白组成和显微形态。将h PDLSCs接种于人尿源性干细胞外基质(UECM)、人牙周膜干细胞外基质(PECM)和纤连蛋白(fibronectin)包被的孔板,以及空白TCP上。利用CCK-8法分别在1、3、5、7、9天检测人牙周膜干细胞增殖情况。接种1小时后检测h PDLSCs细胞动态、静态黏附率,6小时后观察h PDLSCs形态和铺展情况。成骨、成血管、成脂诱导后检测h PDLSCs的分化情况。体内实验:将UECM和PECM分别与纳米羟基磷灰石混合(HA)。将h PDLSCs接种于UECM、PECM包被的孔板,以及空白TCP上成骨诱导7天,将诱导后的h PDLSCs分别接种于人尿源性干细胞外基质-纳米羟基磷灰石混合物(HA/UECM)、人牙周膜干细胞外基质-纳米羟基磷灰石混合物(HA/PECM)和空白纳米羟基磷灰石(HA)。将三种接种h PDLSCs的混合物植入裸鼠双侧背部皮下,6周后取样,脱蜡、包埋、切片进行H&E、Masson染色,以及POSTN和OCN的免疫组化染色,观察h PDLSCs在裸鼠体内成骨分化情况。研究结果:1.流式细胞术结果显示h PDLSCs和h USCs CD90和CD146表达呈阳性,CD31、CD34和CD45表达呈阴性。茜素红染色和油红O染色发现h PDLSCs和h USCs均能形成钙化结节和脂滴。2.扫描电镜结果显示UECM为大量致密纤维交织而成。免疫荧光结果显示UECM中含有纤连蛋白和I型胶原,层粘蛋白5的含量稀少。3.CCK-8、动静态黏附检测和细胞形态显示UECM能够促进h PDLSCs增殖、黏附和铺展。4.RT-PCR检测发现UECM能显著促进h PDLSCs的RUNX2、POSTN、VEGF-A和CD31基因表达。Western blot检测发现UECM能显著促进h PDLSCs的RUNX2和POSTN蛋白表达。茜素红染色发现UECM能够使h PDLSCs形成更多钙结节。5.H&E和Masson染色结果显示HA/UECM组比HA对照组产生更密集的胶原纤维。免疫组化染色结果显示HA/UECM组POSTN和OCN表达量显著高于HA对照组。结论:本实验研究发现UECM由大量交错纤维组成,能显著促进h PDLSCs的增殖、黏附、铺展和成骨、成血管分化,是一种理想的培养h PDLSCs的表面生物材料,为细胞特异性ECM的研究提供了一个独特视角。