研究背景由骨折和疾病引起的骨缺损是目前存在的问题,在这一过程中成纤维细胞能合成和分泌促进骨愈合的胶原纤维和基质成分。且在特定诱导作用下,人成纤维细胞可成骨分化,因其取材简单,适合体外增殖的特点,而被视作骨组织工程应用的重要种子来源之一。细胞骨架扮演着一个桥梁的作用,参与细胞内外环境中各信号分子通路的响应、感知和传导。其中,微丝作为细胞骨架之一,它的完整性,是众多信号分子发挥作用的基础。研究表明,在细胞成骨过程中微丝蛋白表达量增加,形态上呈纤维丝状,整齐排列,在成骨中发挥着重要作用。PDLIM5是一个约63KDa分子大小的胞质蛋白,由N端的PDZ结构域和C端的3个LIM结构域组成。PDLIM5在参与形成特异性蛋白大分子复合物中发挥着重要的介导作用。PDLIM5作为一个肌动蛋白衔接蛋白而受关注,其通过PDZ结构域与细胞骨架和膜蛋白结合,通过LIM结构域与各种蛋白分子相互作用,并在各种细胞类型的分化和其他细胞功能中起关键作用。因此本课题旨在探索细胞骨架相关蛋白PDLIM5与微丝的关系,并在人成纤维细胞中探索其成骨分化的潜在机制。这将为干细胞的研究及骨缺损等骨组织工程相关疾病的治疗以及研究人员能够为患者设计合适的骨填充材料奠定理论基础。实验目的探讨在人皮肤成纤维细胞（HSFs）成骨中PDLIM5与微丝的联系,以揭示PDLIM5通过影响微丝的表达和变化来参与介导成纤维细胞的成骨分化。研究内容及方法利用成骨诱导液诱导人成纤维细胞成骨,通过免疫印迹和qRT-PCR及免疫荧光验证PDLIM5在成骨分化中的表达情况及定位,然后通过慢病毒转染下调PDLIM5表达来验证其对微丝及成骨的影响,最后通过使用微丝稳定剂来探讨PDLIM5-F-肌动蛋白影响成骨分化的可能分子机制。实验结果1.在HSFs成骨分化的第4、7、14、21d,对PDLIM5进行蛋白免疫印迹和qRT-PCR定量分析。随着成骨分化时间的增加,PDLIM5的蛋白和mRNA水平的表达均上调,其差异具有统计学意义（P<0.05）。而免疫荧光和免疫共沉淀结果表明,PDLIM5定位于细胞骨架微丝,并在α辅肌动蛋白1（α-actinin1）免疫沉淀物中检测到PDLIM5。2.慢病毒转染HSFs,下调PDLIM5载体病毒成功下调PDLIM5表达。转染后的HSFs进行CCK8、划痕实验、transwell细胞迁移实验均表明,下调PDLIM5表达后,与对照组相比,shPDLIM5组的细胞增殖和运动能力显著下降,差异具有统计学意义（P<0.001）。3.下调PDLIM5表达后,进行成骨分化处理。ALP染色、qRT-PCR及免疫印迹均表明,下调PDLIM5表达后,HSFs的成骨分化能力明显下降,细胞骨架微丝及相关蛋白和mRNA水平也随之表达下降,其差异有统计学意义（P<0.05）;而免疫荧光显示,下调PDLIM5表达后,发现微丝形态发生改变,由原来细长纤维形状变得短、宽、粗,而在未诱导组没有变化。4.在下调PDLIM5表达后,在成骨培养基中加入微丝稳定剂（Jasplakinolide,JAS）处理,发现JAS可逆转下调PDLIM5表达对HSFs成骨的抑制作用。ALP染色及免疫印迹均表明,（shPDLIM5+JAS）组的成骨能力较对照组（shPDLIM5）显著增强,成骨标志蛋白（RUNX2、ALP）及肌动蛋白等（β-actin、α-actinin1、PDLIM5）表达显著上调。实验结论本研究证实了下调PDLIM5表达显著抑制了成纤维细胞的增殖、运动能力。并通过利用成骨诱导液诱导成纤维细胞成骨分化,验证PDLIM5可通过影响微丝的聚合状态及形态改变来介导成纤维细胞的成骨分化。