组氨酸改性壳聚糖材料在仿生合成和蛋白分离的应用研究

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壳聚糖和聚乳酸是两种性能优良的生物材料,在组织工程和药物释放的应用上均显示其优越性。组氨酸具有很好的pH响应性,将组氨酸接枝到壳聚糖上制备N-组氨酸壳聚糖(NHCS),N-组氨酸壳聚糖保留了壳聚糖上的羟基和部分未取代的氨基以及新增加的具有pH响应性的咪唑基团,保证了其具有良好的生物活性和pH响应性,以期获得一种综合性能优异的“复合型”组织工程材料(N-组氨酸壳聚糖支架、N-组氨酸壳聚糖/聚乳酸复合支架),可以进一步拓宽壳聚糖、聚乳酸在生物医学材料的应用。本文主要研究了组氨酸改性壳聚糖及其与聚乳酸复合材料的制备,并着重研究这些新材料在仿生合成和蛋白分离上的应用。本文利用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺将组氨酸接枝到壳聚糖上,利用冷冻干燥法和浓缩干燥法分别制备N-组氨酸壳聚糖多孔支架(Ns)和N-组氨酸壳聚糖粉末(Np);通过改变组氨酸/壳聚糖的摩尔比及壳聚糖分子量制得一系列不同取代度的N-组氨酸壳聚糖多孔支架(Ns)和N-组氨酸壳聚糖粉末(Np),通过FT-IR、1H NMR、EA、XRD、TGA和SEM等来表征,结果表明NHCS的取代度在3~11%之间,并且取代度受组氨酸的投加量和壳聚糖分子量的影响,组氨酸的投加量增大或壳聚糖分子量减小,取代度提高,支架孔径增大。NHCS均可形成泡沫状、海绵状等多种多孔材料,孔尺寸在5~120μm之间,孔隙率均大于85%,NHCS支架可望满足成纤维细胞、皮肤组织重建和骨组织工程的需要。在冷冻诱导相分离制备N-组氨酸壳聚糖多孔支架(Ns)的基础上进行二次相分离,考察不同取代度的N-组氨酸壳聚糖多孔支架和不同的N-组氨酸壳聚糖/聚乳酸质量之比等因素,制备一系列N-组氨酸壳聚糖/聚乳酸复合(NHCS/PLLA)支架,通过FT-IR、XRD、TGA和SEM等来表征N-组氨酸壳聚糖/聚乳酸复合支架,结果表明,NHCS/PLLA质量之比减小,复合支架孔隙率减小,密度增大。复合支架材料的孔尺寸约在13~18μm,孔隙率均大于92%,不同组成的NHCS/PLLA支架的力学性能测试表明其抗压强度和弹性模量分别在0.33~0.78MPa和1.75~5.28MPa之间,有望适用于软骨组织工程支架。利用浓缩干燥法所制备N-组氨酸壳聚糖粉末(Np)作为有机基质,在模拟体液中仿生调控合成纳米羟基磷灰石,探讨组氨酸/壳聚糖摩尔比、壳聚糖分子量、钙离子初始浓度、温度和陈化时间等因素对NHCS调控合成羟基磷灰石的影响,并以不添加NHCS的水体系、模拟体液体系作对照,研究结果表明在不添加NHCS的水体系、模拟体液体系都能得到微米级的羟基磷灰石块体。但在添加NHCS的模拟体液体系中可有效控制合成球形和梭状的纳米羟基磷灰石,以壳聚糖分子量为50kD、组氨酸与壳聚糖摩尔比为2:1所制备的NHCS(Np7)为有机基质,NHCS投加量为0.01g、Ca2+离子初始浓度为0.01mol·L-1、反应温度为37.0℃、陈化时间为24h时调控效果最好,梭状HAP长~200nm,宽~40nm,且含有少量碳羟基磷灰石,与自然骨成分相似。本研究还对NHCS不同投加量影响羟基磷灰石形成的机理作初步探讨,为仿生合成羟基磷灰石及其骨骼修复等提供参考。利用浓缩干燥法所制备N-组氨酸壳聚糖粉末(Np)作为有机基质,在水体系中仿生调控合成碳酸钙,探讨不同的组氨酸/壳聚糖摩尔比、壳聚糖分子量、钙离子初始浓度、pH值、温度和陈化时间等因素对NHCS调控合成碳酸钙的影响,并以不添加NHCS的水体系作对照。结果表明,在纯水条件下,生成的产品为颗粒较大单一立方体的方解石。NHCS的添加能对合成的碳酸钙晶型及形貌起到调控作用。NHCS在仿生合成碳酸钙过程对体系pH具有响应作用,体系pH不同,球形球霰石晶体的含量也不同,当pH为6.5时,球霰石的含量最低为66.2%,当pH远离6.5时,球霰石的含量可增加到93.7%。当陈化时间的延长,球霰石的含量缓慢减小,24h后球霰石的含量为86.2%。此外,对体系pH值、陈化时间等因素影响球霰石形成的机理也作初步探讨,为仿生合成其他生物矿物提供借鉴。探究NHCS支架、NHCS/PLLA复合支架的吸附牛血清白蛋白(BSA)的性能,研究结果表明NHCS支架、NHCS/PLLA复合支架对牛血清白蛋白溶液吸附效果良好,吸附容量Qe在335.84~1048.64mg·g-1之间。单纯NHCS支架中Ns10对BSA溶液的吸附能力最好,吸附容量Qe达820.90mg·g-1,而复合支架种以NPs3较佳,吸附容量Qe高达928.53mg·g-1。Ns10和NPs3可重复使用,重复吸附洗脱五次后的两种支架对BSA的吸附容量只降低了1.00%左右,有望为BSA或其他蛋白的分离纯化及回收利用提供新的载体,也有望作为组织工程用的支架材料。
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