长链非编码RNA G003929对人卵巢癌细胞迁移和侵袭的影响及机制研究

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目的:本研究通过对人卵巢上皮细胞癌(epithelial ovarian cancer,EOC)组织和对照卵巢组织进行高通量转录组测序以及对人卵巢癌细胞SKOV3、HO8910、A2780和人卵巢上皮细胞HOSEpi C进行基因芯片检测,获得新发现的参与卵巢癌发生、发展和转移的Lnc RNAs,为筛选早期诊断标志和治疗靶点,建立新的卵巢癌早期诊断和治疗方法奠定基础。方法:(1)对卵巢上皮细胞癌组织和对照卵巢组织进行高通量转录组测序检测,对卵巢癌细胞SKOV3、HO8910、A2780和卵巢上皮细胞HOSEpi C进行基因芯片检测。对转录组测序和基因芯片结果进行Lnc RNA亚组分析包括高度保守、组织特异性、疾病相关和生物过程相关的Lnc RNA以及Gene ontology-biological process(GO-BP)和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)pathway分析。(2)q RT-PCR检测卵巢癌细胞系SKOV3、HO8910、A2780、OVCR3、3AO和卵巢上皮细胞系HOSEpi C以及卵巢上皮细胞癌组织和对照卵巢组织中Lnc RNAs的表达量。(3)构建过表达Lnc RNA G003929质粒,在卵巢癌细胞SKOV3和HO8910中过表达Lnc RNA G003929。(4)EDU、CCK8检测卵巢癌细胞SKOV3和HO8910以及过表达Lnc RNA G003929的卵巢癌细胞SKOV3和HO8910的增殖能力。(5)Transwell迁移和侵袭实验以及划痕实验检测卵巢癌细胞SKOV3和HO8910以及过表达Lnc RNA G003929的卵巢癌细胞SKOV3和HO8910的迁移和侵袭能力。(6)开放阅读框(ORF)和基于比较基因组(Phylo CSF)分析方法对Lnc RNA G003929编码能力进行分析。(7)荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization,FISH)实验明确Lnc RNA G003929在卵巢癌细胞SKOV3中的亚细胞定位。(8)cat RAPID、lnc Pro和Anno Lnc在线工具预测Lnc RNA G003929结合的蛋白。Western blot检测卵巢癌细胞SKOV3和HO8910以及过表达Lnc RNA G003929的卵巢癌细胞SKOV3和HO8910中蛋白的表达水平。(9)FISH与免疫荧光(Immunofluorescence technique,IF)实验检测Lnc RNA G003929和锌指E盒结合蛋白1(zinc finger E-box binding homeobox 1,ZEB1)蛋白在SKOV3中的共定位。RNA结合蛋白免疫沉淀(RNA Immunoprecipitation,RIP)实验证实Lnc RNA G003929与ZEB1结合。结果:(1)转录组测序测得216个表达量上调的Lnc RNAs,731个表达量下调的Lnc RNAs。基因芯片测得227个表达量上调的Lnc RNAs,2875个表达量下调的Lnc RNAs。133个Lnc RNAs具有高度保守性、卵巢组织特异性且与卵巢癌发生发展过程相关。(2)7个Lnc RNAs的表达量在卵巢癌细胞SKOV3、HO8910、A2780、OVCR3和3AO与卵巢上皮细胞HOSEpi C中有显著差异。其中RP3-325F22.5和Lnc RNA G003929在卵巢上皮细胞癌组织和对照卵巢组织间有显著差异。而Lnc RNA G003929具有卵巢组织特异性且参与肿瘤的发生发展,因此选取Lnc RNA G003929进行功能和机制研究。(3)Lnc RNA G003929不具有Kozak序列,22个ORF均小于200nt,对所有正义链进行BLAST发现这些短肽均没有同源性的蛋白。Phylo CSF结果表明Lnc RNA G003929序列不具有保守性,以上结果均说明Lnc RNA G003929不具有编码蛋白的能力。(4)将Lnc RNA G003929全长序列构建到Plvx-Zsgreen-puro过表达质粒中,q RT-PCR检测结果表明卵巢癌细胞SKOV3和HO8910中确实过表达Lnc RNA G003929。(5)EDU、CCK8实验结果均表明过表达Lnc RNA G003929的卵巢癌细胞SKOV3和HO8910的增殖能力并没有明显低于卵巢癌细胞SKOV3和HO8910。(6)过表达LncRNA G003929的卵巢癌细胞SKOV3和HO8910的迁移能力降低但是侵袭能力增加。(7)FISH结果表明LncRNA G003929主要定位于卵巢癌细胞SKOV3的胞核,极少部分存在于胞质。(8)Anno Lnc、lnc Pro和cat RAPID预测结果均表明Lnc RNA G003929与ZEB1蛋白结合。Anno Lnc和lnc Pro预测结果表明Lnc RNA G003929与基质金属蛋白酶-9(matrix metalloprotein-9,MMP9)蛋白结合。过表达Lnc RNA G003929的SKOV3和HO8910细胞中ZEB1的表达量降低,MMP9的表达量升高。(9)SKOV3细胞中Lnc RNA G003929与ZEB1共同定位于细胞核中。RIP实验结果表明Lnc RNA G003929与ZEB1结合。结论:卵巢组织特异性Lnc RNA G003929与卵巢癌的迁移和侵袭密切相关,有可能成为卵巢上皮细胞癌新的诊断标志和治疗靶点。
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