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新城疫(Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)引起的对世界养禽业危害极为严重的一种烈性传染病。NDV的基因组为单股、不分节段的负链RNA，基因组结构模式为：3’-NP-P-M-F-HN-L-5’，分别编码核衣壳蛋白(Nucleocapsid，NP)，磷蛋白(Phosphoprotein，P)，基质蛋白(Matrix protein，M)，融合蛋白(Fusion protein，F)，血凝集-神经氨酸酶(Hemagglutinin-neuraminidaseprotein，HN)和大分子蛋白(Large protein，L)。NP基因共编码489个氨基酸，其中N端(1-400位氨基酸)比较保守，C端(401-489位氨基酸)在不同病毒之间的差异则比较大。在基因组上，NP基因的非编码区同样属于高变区，研究发现后期NDV毒株的NP基因非编码区出现了6nt插入的现象，而且带有6nt插入的毒株对水禽的致病性明显增加。2007年我室以基因VII型NDV ZJ1株为骨架，构建了NP基因来源于Beaudette C株的重组嵌合病毒rZJ1/BNP，其毒力与ZJ1株相比明显减弱，证明NP基因与NDV的毒力存在一定的相关性。为了鉴定NP基因上与毒力相关的区域，本论文在ZJ1株反向遗传操作的基础上，对NP基因上三个主要区域的生物学功能进行了研究。
1.NP基因非编码区与病毒毒力的关系
参照Beaudette C株NP基因序列，设计两对引物，通过overlapping PCR方法扩增BC株NP基因，并在基因非编码区1646-1647之间插入六个碱基“CTCCCA"，利用引物两端的酶切位点Eco81 I和Sca I将PCR扩增产物与中间质粒NDV7.2相连，阳性质粒经Age I和Xba I酶切后连入全长cDNA克隆pNDV/ZJ1中得到了重组质粒pZJ1/SBNP6A。
将重组质粒和三个辅助质粒pCI-NP、pCI-P、pCI-L共转染BSR-T7/5细胞后，成功拯救出了重组病毒rZJ1/SBNP6A，重组病毒的MDT、ICPI和生长曲线的测定结果显示：rZJ1/SBNP6A的毒力与rZJ1/SBNP基本相似，均为中强毒，表明NP基因非编码区6碱基的插入对病毒毒力几乎没有产生影响。
参照Beaudette C和ZJ1株NP基因的序列，分别设计两对引物，通过overlapping PCR方法构建出编码区和非编码区分别来源于BC株的两个NP嵌合基因，以嵌合NP基因替换ZJ1株的相应部分，进而构建了两个新的全长cDNA克隆pZJ1/SNCR和pZJ1/SORF。全长克隆和辅助质粒一起共转染BSR-T7/5细胞后，获得两个重组嵌合病毒rZJ1/SNCR和rZJ1/SORF。重组病毒的MDT、ICPI和生长曲线测定结果显示：rZJ1/SNCR为强毒与rZJ1毒力一致；rZJ1/SORF为中强毒，与rZJ1/SBNP毒力相似。表明：决定NDV毒力的区域主要位于NP基因的编码区，而非编码区则对病毒的毒力无明显影响。
2.NP基因保守区和高变区与病毒毒力的关系
不同基因型NDV NP蛋白序列比对显示，不同毒株在整个编码区的同源性为89.8-96.5％，第1-400位氨基酸的同源性高达94.2-99％，表明不同时期不同基因型毒株之间氨基酸比较保守，而401-489位氨基酸的同源性仅为50.0-71.1％，不同毒株之间氨基酸差异比较大。为了澄清保守区和可变区与病毒毒力之间的关系，本研究通过overlapping PCR方法，将rZJ1 NP基因中的高变区和保守区分别换成BC株NP基因的相应区域，进而构建了全长cDNA克隆pZJ1/SHR和pZJ1/SCR。重组质粒和辅助质粒一起共转染BSR-T7/5细胞后，获得了重组病毒rZJ1/SHR和rZJ1/SCR。重组病毒的毒力和复制动力曲线测定显示，rZJ1/SHR为强毒，与rZJ1毒力相似；rZJ1/SCR为中强毒，其毒力与rZJ1/SBNP相似。
上述结果表明：决定病毒毒力的区域主要位于NP基因的保守区。