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研究目的关于动脉粥样硬化（Atherosclerosis,As）的发病机制一直以来存在争议,近年来得到广泛认可的炎症学说认为:在As早期,因内皮损伤引发炎症反应,导致脂质沉积氧化,单核细胞迁移至内皮以下,在多种细胞因子作用下分化为巨噬细胞,上调清道夫受体的表达,摄取大量ox-LDL,形成泡沫化细胞。既然巨噬细胞泡沫化是As早期的关键事件,那么以巨噬泡沫细胞为靶点对As形成进行早期抗炎干预及调节胆固醇代谢成为防治As的主要方向。中医对As的致病机理有多种不同看法,有学者提出“湿热化瘀”学说,认为湿热蕴结于血脉是As的主要病理环节,因此治疗上应以清热化湿消瘀法作为主要治则。临床中选用王氏连朴饮加味丹参、赤芍来治疗As病人,取得较好疗效。王氏连朴饮是《霍乱论》温病经典方,方中以黄连、厚朴为君药,黄连能清热化湿,厚朴能燥湿消痰,两味药的合用可以起到清热化湿的功效。综合上述中、西医两种观点,找出相关联部分,同为As早期的病机,西医认为是炎症反应和巨噬细胞泡沫化,中医认为是湿热蕴结,那么采用清热化湿的方法能不能抑制炎症反应泡沫细胞的形成?在这样的假说下,我们结合临床使用王氏连朴饮治疗As病人,受其启发,研究该方中的主要药效成分,即小檗碱、厚朴酚、和厚朴酚,联合用于THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞,研究其对泡沫细胞的炎症反应和胆固醇代谢方面的影响,研究目的在于揭示三种成分的合用能否抑制巨噬细胞的泡沫化过程以及其可能的干预机制,为临床中As防治提供实验数据,也为As的中医病机研究提供参考。研究方法与内容（一）THP-1巨噬细胞源性泡沫细胞模型的建立及鉴定1、以佛波酯诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞,并以鸡红细胞吞噬实验验证2、将THP-1源性巨噬细胞与ox-LDL共孵育建立泡沫细胞模型3、油红O染色和HPLC-MS法测定胆固醇含量鉴定泡沫细胞模型（二）小檗碱联合厚朴酚对泡沫细胞的形态及胞内胆固醇的影响1、MTT法考察药物的给药浓度和给药时间2、结合油红O染色进行形态学观察3、HPLC-MS法测定细胞内胆固醇含量（三）ELISA法检测巨噬细胞TNF-α、IL-1α的表达以佛波酯诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞后给予LPS刺激,并给予药物处理,收集培养上清液,以ELISA试剂盒测定其TNF-α、IL-1α的浓度。（四）FCM法检测泡沫细胞CD36的表达以佛波酯和ox-LDL诱导THP-1细胞分化为巨噬泡沫细胞,给予药物处理,收集培养上清液,与FITC标记的鼠抗人CD36抗体孵育,测定细胞CD36表达率。（五）qRT-PCR法检测泡沫细胞ABCA1 mRNA的表达用TRIzol法提取各组细胞的总RNA,取2μg的总RNA用Invitrogen公司的SuperScriptⅢ按试剂盒说明书操作合成为cDNA后,置八联管中,每个样品设三个复孔,加入SYBR Green染料,采集各孔荧光,记录Ct值,以β-actin为管家基因,采用相对定量2-ΔΔCt法计算各组细胞中相对于对照组ABCA1mRNA的表达水平。研究结果（一）泡沫细胞模型的建立与鉴定1、泡沫细胞模型的建立:取对数生长期的THP-1单核细胞,用无血清的RPMI 1640基础培养液调整细胞浓度为1×106个/mL,接种于6孔培养板,每孔2mL,加佛波酯使终浓度为160nmol/L,诱导24 h,轻轻吸去上清液,换含3%胎牛血清的RPMI 1640培养液,并加入终浓度为80 mg/L的oxLDL,共同孵育48h。2、泡沫细胞模型的鉴定:①油红O染色:将细胞接种于6孔培养板内,诱导建模结束后,吸去上清液,用PBS洗三次,冰冻的4%多聚甲醛固定5min。PBS洗一次,再置于丙二醇中固定5min。轻轻吸去丙二醇,加入0.5%油红O的丙二醇溶液,置60℃烤箱中染色15min,用85%丙二醇冲浸洗5min,再用PBS洗三次,染色后,立即置显微镜下观察并摄像。②HPLC-MS法测胆固醇含量:色谱条件:色谱柱:Hypersil C18柱（2.1mm×150mm,3μm）;流动相:甲醇-水（90:10）;流速:0.5mL/min;柱温:室温;进样量:10μL。质谱条件:离子源:大气压化学电离源（APCI）;放电电流5μA;气化温度350℃;离子传输毛细管温度250℃;鞘气（N2）流速30 arbitrary units;辅助气（N2）流速5 arbitrary units;正离子方式检测;扫描方式:选择性离子检测（SIM）;检测离子:胆固醇,[M+H]+,m/z369,豆甾醇,[M+H]+,m/z 395。（二）小檗碱联合厚朴酚对泡沫细胞的影响1、由MTT法检测联合用药的IC50,确定用于泡沫细胞时的给药浓度为小檗碱5μmol/L、厚朴酚2μmol/L、和厚朴酚2μmol/L,用于巨噬细胞时的给药浓度为小檗碱10μmol/L、厚朴酚4μmol/L、和厚朴酚4μmol/L。给药时间均为24h以内。2、经ox-LDL诱导后,模型组细胞体积增大,由原来的梭形变为不规则圆形,经油红O染色后,细胞胞内大量红色脂质颗粒;中药组细胞仍呈现梭形,洛伐他汀组细胞呈规则圆形且晶莹透亮,两组细胞经油红O染色后,胞内红色脂质颗粒比模型组少。3、泡沫细胞分别经洛伐他汀和中药处理24h后,测量两组细胞内胆固醇含量,与模型组相比较,中药组和洛伐他汀组细胞内胆固醇明显减少,说明二者均具有抑制细胞泡沫化的作用;并且中药组与洛伐他汀组相比,无显著性差别。（三）小檗碱联合厚朴酚、和厚朴酚可抑制THP-1巨噬细胞TNF-α的分泌,并且与阳性对照药地塞米松组无显著性差异。IL-1α因表达量低未检出。（四）以流式细胞术测定细胞表面CD36的表达,结果表明经PMA和oxLDL刺激分化为巨噬泡沫细胞后CD36表达率为84.6%,小檗碱联合厚朴酚处理后降为13.3%,并且比洛伐他汀组降低更多。（五）THP-1细胞经ox-LDL诱导成为泡沫细胞后ABCA1 mRNA表达下降,给予洛伐他汀处理后无明显改善,但给予小檗碱、厚朴酚及和厚朴酚联合处理后,ABCA1mRNA比单核细胞上升近一倍,说明联合用药能上调ABCA1表达,促进脂质外流。结论小檗碱、厚朴酚及和厚朴酚联合用于THP-1源性泡沫细胞后,细胞内总胆固醇含量减少,巨噬细胞泡沫化受到抑制,其干预机制可能与减少炎症介质、抑制CD36及上调ABCA1表达有关。特别在对ABCA1 mRNA的表达方面,洛伐他汀抑制其表达,不利于脂质外流,而中药的联合使用既能下调CD36减少脂质摄取,又能上调ABCA1促进脂质外流,有利于As的防治,体现了中药多组分联合作用的优势。