研究背景和目的:Hedgehog信号通路在细胞生长、胚胎形成及维持人体组织内环境稳定方面扮演重要的角色。同时更多研究表明Hedgehog信号参与多种肿瘤的形成及发展,如基底细胞癌、消化道肿瘤、卵巢癌等。Hedgehog信号通路的主要成员有Hh配体,12次跨膜蛋白受体Ptch,7次跨膜蛋白Smo,胞浆负调控蛋白Sufu,转录因子Gli以及下游相关靶基因。Sufu(Suppressor of fused)作为Hedgehog信号通路的重要调控因子,主要作用是抑制下游转录因子Gli的活性,而Sufu蛋白的调控及机制并不清楚。为了研究Sufu蛋白的调控机制,我们使用酵母双杂交的方法,以Sufu作为诱饵蛋白获取未知相互作用的蛋白,我们发现了Sufu与Nek2(NIMA-related kinase 2)的相互作用。Nek2是一种细胞周期相关的丝氨酸/苏氨酸激酶,高表达于已复制的2个中心体的邻近端。但在未同步化细胞中,约有90%的Nek2位于中心体之外,且功能未知。在哺乳动物细胞中,Nek2有三种剪接异构体,分别是Nek2A、Nek2B、Nek2C,其中Nek2A是全长形式。Nek2A在多种肿瘤组织中高表达,并且高表达患者预后不良。因此,研究Nek2A与Sufu蛋白相互作用及分子机制,丰富Hedgehog信号通路调节网络,为深入揭示肿瘤发生发展的具有重要意义。研究方法:1.Nek2A与Sufu相互作用,及相互作用结合区域实验。外源及内源蛋白质免疫共沉淀验证两个蛋白质之间存在相互作用;GST pull down技术寻找相互作用结合区域。2.Nek2A影响Sufu蛋白水平变化,以及相互作用的分子机制。过表达和干扰方法,Western blot检测Sufu蛋白水平变化,Q-PCR检测Sufu的mRNA水平变化;特异性磷酸化的抗体检测磷酸化水平变化,质谱分析磷酸化位点。3.Nek2A通过与Sufu的相互作用影响Hedgehog信号通路活性。使用双荧光素酶报告系统,检测荧光素酶活性;运用核质分离技术,检测Hedgehog信号通路转录因子Gli2在胞浆核中蛋白水平分布变化。4.使用细胞免疫荧光方法,检测Nek2A影响Sufu在纤毛的定位变化。研究结果:1.前期通过酵母双杂交实验发现了与Sufu相互作用的蛋白Nek2A,并运用外源及内源蛋白质免疫共沉淀验证在哺乳动物细胞中Nek2A与Sufu存在相互作用。进一步利用GST pull down技术,确定Nek2A与Sufu的N端(1-367 aa)结合。2.过表达Nek2A,发现Sufu的蛋白水平显著升高,而mRNA水平没有明显变化,说明Nek2A影响Sufu蛋白水平的变化而不是转录水平的变化。放线菌酮抑制蛋白质合成实验,结果发现在过表达Nek2A降低Sufu蛋白的降解速度。进一步研究表明,过表达Nek2A激酶失活体,Sufu蛋白水平降低,提示Nek2A对Sufu蛋白的稳定作用是激酶依赖的。通过磷酸抗体检测的方法,发现Nek2A使得Sufu蛋白的磷酸化水平增高;再用质谱分析技术,发现Sufu蛋白T225和S352两个位点被Nek2A特异磷酸化;为了验证这两个磷酸化位点,我们构建Sufu的点突变质粒,再检测Sufu蛋白稳定性,发现同时突变两个位点使Sufu蛋白稳定性减弱。3.研究Nek2A对Hedgehog信号通路活性的影响,我们使用双荧光素酶报告系统,结果发现转染Nek2A后使荧光信号值降低,这提示被磷酸化修饰的Sufu仍然具有抑制Hedgehog信号通路活性的功能。我们运用核质分离技术,发现过表达Nek2A时细胞核中Gli2的含量减少。4.我们在NIH3T3细胞中诱导纤毛生成,用乙酰化的微管蛋白抗体标记纤毛,发现干扰Nek2A使得Sufu在纤毛中定位增多(P<0.05),这提示Nek2A还可能负调控经典的Hedgehog信号。研究结论:1.Nek2A与Sufu蛋白存在相互作用,并且Nek2与Sufu的N端结合。2.Nek2A可以稳定Sufu蛋白,这种稳定作用是通过磷酸化修饰起作用的。3.Nek2A稳定的Sufu蛋白有抑制Hedgehog信号通路活性的功能。