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气味受体(odorant receptors)是嗅觉系统的关键成分之一,对气味受体的研究是了解昆虫化学信号分子识别机制的重要基础。昆虫气味受体基因分为两类,一类是编码传统气味受体(conventional receptors)的基因,此类基因在不同昆虫间同源性相对较低;另一类是Or836基因,该类基因在不同昆虫间保守性非常高,编码的受体统称为Or83b家族受体(Or83b family receptors),是一类非典型的气味受体(atypical odorantreceptors),与传统气味受体不同,此类受体可能不感受具体的气味分子,在大多数嗅觉神经元中表达。Or83b是昆虫感受气味分子所必需的受体蛋白,传统气味受体必需和非特异的气味受体Or83b共同表达才具有嗅觉功能。从害虫防治角度看,可以针对具有普遍意义的Or83b,研究其结构特征与分子感受机制,开发设计针对昆虫Or83b功能的行为调节剂。
本文以小菜蛾Plutella xylostella(L.)为试虫,克隆了小菜蛾Or83b气味受体蛋白基因PlxyOr83b,对其进行了原核表达,建立了其增强型绿色荧光蛋白(Enhance GreenFluorescent Portein,EGFP)真核表达体系,为研究小菜蛾寄主选择行为的分子机理提供了基础。
根据GenBank收录的Or83b基因序列设计引物,以小菜蛾总cDNA为模板,采用RT-PCR方法扩增目的基因,将其克隆至T载体并测序,克隆得到小菜蛾PlxyOr83b,该基因阅读框长1413 bp,编码471个氨基酸,预测等电点7.19,在GenBank中登录号为GQ923610。Signal P分析推测氨基酸序列,未发现信号肽。经Blast软件分析表明该片段与GenBank登录的其它昆虫的Or83b序列相似性显著,其序列与黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、烟芽夜蛾(Heliothis virescens)、烟夜蛾(Helicoverpaassulta)、草地螟(Loxostege sticticalis)等相似性均高于80％。
将PlxyOr83b重组到表达载体pET-32a(+)中,获得重组质粒pET-PlxyOr83b,并转入原核细胞中表达。SDS-PAGE和Western blot分析表明,经IPTG诱导后,PlxyOr83b能在大肠杆菌BL21高效表达,电泳检测融合蛋白分子质量为32.0 kD,pET-PlxyOr83b原核表达的适宜条件为28℃,1.0 mmol/L,IPTG诱导4 h。
根据pEGFP-N1载体和pEGFP-C1载体的酶切位点及PlxyOr83b的ORF序列分别设计2对扩增引物,在上、下游引物5端分别引入XhoⅠ和HindⅢ酶切位点,将质粒pEGFP-N1,pEGFP-C1,及Or83b PCR产物分别双酶切,再将回收的pEGFP-N1和pEGFP-C1大片段分别与Or83b基因片段重组。对重组质粒pEGFP-N1-PlxyOr83b和pEGFP-C1-PlxyOr83b进行PCR和双酶切鉴定并测序,构建以pEGFP-N1和pEGFP-C1为载体的真核表达质粒。
将鉴定出的阳性克隆送测序,以构建正确的pEGFP-N1-PlxyOr83b重组质粒转染斜纹夜蛾离体细胞系SL-1细胞,转染后在荧光显微镜下可见绿色荧光蛋白的表达,Western blot检测证实转染细胞中PlxyOr83b正确表达。PlxyOr83b真核表达体系的成功构建为深入研究小菜蛾气味受体的结构及其与不同抑制剂相互作用的机理,以及设计小菜蛾气味受体抑制剂提供了基础。