研究背景非霍奇金淋巴瘤(Non-hodgkin’s lymphoma.NHL)为一组起源于淋巴组织呈现多样化的免疫细胞性肿瘤,占新发肿瘤病例4%,占肿瘤相关死亡病例3%,列新发肿瘤第7位,是一类严重影响人类健康的疾病。弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma,DLBCL)是NHL最常见的亚型,具有典型的异质性,病因以及发病机制尚未清楚。DLBCL间质中存在大量的各类型炎症细胞,主要包括巨噬细胞、T细胞亚型、肥大细胞等。DLBCL不仅是肿瘤细胞自主增殖的结果,其存活及增殖也依赖于来自微环境的信号。通过研究种类繁多的背景炎性细胞与肿瘤细胞的相互作用,这可能成为打开探索DLBCL发病机理的新领域。从2003年开始,炎症与肿瘤的关系越来越引起研究者的关注,其中趋化因子及受体介导肿瘤细胞与炎症细胞的相互作用成为研究热点。正是基于此,本课题组自2010年开始了微环境与淋巴瘤发生发展的关系研究。首先利用GeneSifter软件和BRB-Array Tools分析平台对公共基因芯片数据库GEO(Gene Expression Omnibus)中淋巴瘤组织的基因芯片表达数据进行统计分析,试图寻找与淋巴瘤微环境中炎症细胞关系密切的细胞因子,结果发现新型趋化因子CXCL16(CXC chemokine ligand 16)及其受体 CXCR6(CXC chemokine receptor 6)是与NHL关系密切的相关因子之一。CXCL16/CXCR6是否参与DLBCL炎性背景细胞与肿瘤细胞之间的相互作用?炎症细胞是否能对DLBCL细胞产生生物学效应?机制又如何?这些科学问题的研究有助于阐明炎症细胞与DLBCL的关系并为其防治提供新思路。1.CXCL16 及其受体 CXCR6CXCL16属于CXC趋化因子家族成员,因其同时具有受体的功能,也被称为磷脂酰丝氨酸以及氧化脂蛋白的清道夫受体。人类CXCL16基因定位于染色体17p13上,编码254个氨基酸。CXCL16蛋白有跨膜型(trans-membrane CXCL16,TM-CXCL16)和可溶性(soluble CXCL16,sCXCL16)2 种存在形式。解整合素金属蛋白酶(A disintegrin and metalloproteinase,ADAM)可以促进TM-CXCL16胞外域的脱落从而成为sCXCL16。CXCR6是CXCL16的唯一受体,基因位于第3号染色体上,是由7段跨膜区序列、胞内的羧基端及胞外的氨基端组成的G蛋白偶联受体。2.CXCL16/CXCR6 研究现状CXCL16主要执行的生物学功能有两种:清道夫受体功能及趋化功能。开始对CXCL16/CXCR6的研究多集中在免疫及炎症相关疾病中,CXCL16/CXCR6可通过诱导和活化T细胞、巨噬细胞等免疫细胞,促进动脉粥样硬化、风湿性关节炎、痛风及多发性硬化的发生发展,并在肝炎、肺炎等疾病的临床进展中均起重要作用。近年来,国内外研究发现多种肿瘤组织及肿瘤细胞株中存在CXCL16/CXCR6共表达现象,包括胰腺癌、乳腺癌及前列腺癌等恶性肿瘤。共表达现象提示了肿瘤细胞可能具有自分泌功能,可自分泌sCXCL16作用于自身发挥生物学功能。CXCL16/CXCR6对不同种类恶性肿瘤的预后影响不同,在大多数文献报道中,是恶性肿瘤预后不良的影响因素,如促进卵巢癌、膀胱癌、宫颈癌、神经母细胞瘤及恶性黑色素瘤的侵袭和转移,参与神经胶质瘤的恶性转化,促进淋巴瘤的分化;但抑制胃癌和肾癌的浸润和转移,改善生存预后。此外,研究报道,血清中sCXCL16浓度可作为结直肠癌诊断及预测肝转移的新指标,提示了 sCXCL16在临床潜在的应用价值。综上所述,在多种恶性肿瘤中CXCL16/CXCR6存在过表达,但在不同肿瘤类型中临床意义有所不同。淋巴造血系统肿瘤中,对CXCL16/CXCR6的研究开展较晚,通过Pubmed数据库查询,截至2016年2月,仅有4篇文献涉及淋巴瘤中CXCL16/CXCR6的研究,研究内容均为蛋白的表达,未涉及功能及机制方面的探讨。Hanamoto等在研究系列肿瘤中的趋化因子表达谱时,最早观察到霍奇金淋巴瘤(Hodgin lymphoma,HL)来源细胞株中存在CXCL16表达,但未深入研究表达的意义。Deutsch等观察到在胃粘膜相关淋巴瘤向DLBCL转化过程,常出现CXCR6等受体表达上调。Darash-Yahana等在39例淋巴瘤组织检测到25例有CXCL16高表达(64.10%),但未进一步对不同亚型的表达差异进行分析。在国内,本课题组最先关注了 CXCL16/CXCR6在淋巴瘤中的作用及机制,前期利用q-PCR、WB及荧光共聚焦等多种方法在mRNA基因和蛋白水平对不同淋巴瘤细胞株中CXCL16和CXCR6的表达进行了检测,发现在B细胞、T细胞淋巴瘤及HL等来源不同的淋巴瘤细胞和细胞中CXCL16广泛表达,但不同细胞株中存在表达差异;CXCL16能促进HL细胞增殖,并与调节T细胞(T regulatory,Treg)产生相互作用。值得注意的是ELISA检测发现DLBCL细胞可分泌高水平的sCXCL16。尽管在DLBCL细胞株观察到CXCL16/CXCR6共表达现象,但是在临床标本中的表达尚缺乏全面的了解,CXCL16/CXCR6的表达与临床病理特征的相关性尚未见研究报道。因此本研究目标一:观测CXCL16/CXCR6在DLBCL组织及细胞株中的表达及临床意义。鉴于DLBCL组织和细胞上的CXCL16/CXCR6共表达现象,我们不禁思索:高水平的sCXCL16是否产生自分泌作用?其中的机制如何?这些成为本研究的目标之二。在自分泌实验研究中我们观察了外源性添加重组蛋白sCXCL16对于DLBCL细胞增殖的影响,结果显示sCXCL16对DLBCL细胞增殖作用的影响不显著,但将sCXCL16分别联合4种细胞因子共同作用时意外发现,联合TNF-α可以协同抑制DLBCL细胞株OCI-Ly8细胞及OCI-Ly10细胞增殖并促进细胞凋亡。TNF-α联合sCXCL16协同抑制DLBCL增殖作用的机制如何?这是本研究目标之三。既往的报道提示TNF-α主要来源于M1型巨噬细胞。巨噬细胞如何趋化至DLBCL肿瘤组织,目前尚未明确,在NHL的另外一种类型滤泡性淋巴瘤中发现,源于基质细胞分泌的CCL2可以募集单核细胞并可以将其诱导为促进肿瘤形成的表型,这提示趋化因子在肿瘤中能发挥对炎症细胞的趋化作用。继而本课题针对DLBCL中常出现的M1型巨噬细胞,探讨了 sCXCL16是否参与DLBCL细胞与M1型巨噬细胞的相互作用。鉴于解整合素金属蛋白酶(ADAM)在TM-CXCL16向sCXCL16转化中的作用,以及文献报道中TNF-α与ADAM的关系,本研究最后还对于DLBCL细胞sCXCL16的分泌调节及与TNF-α的关系进行了探讨。研究目的1.观察CXCL16/CXCR6在DLBCL中的表达及临床意义;2.研究DLBCL瘤细胞sCXCL16的自分泌作用及机制;3.探讨DLBCL瘤细胞sCXCL16对M1型巨噬细胞旁分泌作用及机制。研究方法及结果1.CXCL16/CXCR6在DLBCL中的表达及临床意义1.1研究方法收集2009年至2012年间在南方医院就诊并确诊为DLBCL的患者46例,收集临床数据,进行随访;从美国Biomax公司购买淋巴瘤组织芯片2张,其中含有DLBCL病例76例,其余淋巴瘤亚型共74例;选择DLBCL来源的细胞株OCI-Ly3、OCI-Ly8及OCI-Ly10进行本课题研究。通过ICC、IF、RT-PCR及WB方法对来源于DLBCL细胞株的CXCR6表达进行检测;通过IHC方法检测组织芯片(含DLBCL病例76例)及46例临床石蜡组织标本的CXCL16或CXCR6蛋白的表达,并对医院来源的46例病例进行生存状况随访,通过统计学分析蛋白表达与生存预后关系。选取27例淋巴结反应性增生病例作为对照组。1.2实验结果(1)IHC检测结果发现,DLBCL中CXCL16蛋白表达较对照组高(组织芯片 69.74%vs.对照组 7.41%,P<0.05;医院标本 76.09%vs.对照组 7.41%,P<0.05);而CXCR6的表达率较对照组低(医院标本73.71%vs.对照组96.30%,P<0.05)。ICC及IF检测结果发现,OCI-Ly3、OCI-Ly8及OCI-Ly10细胞膜均存在CXCR6表达。(2)在46例医院来源的DLBCL组织中,CXCL16/CXCR6的共表达率与对照组比较差异有统计学意义(65.22%vs.7.41%,P<0.05);CXCR6与CXCL16的表达强度呈正相关(r=0.293,P=0.000)。(3)CXCL16的表达具有性别和年龄差异,男性组表达更高(男性vs.女性,Z=-5.74,P=0.00);低于 60y 的表达更高(60y≤vs.>60y,Z=-7.24,P=0.00);CXCR6的表达也观察到具有与CXCL16类似的性别及年龄差异。(4)在46例医院来源病例中,CXCR6(+)DLBCL患者的平均累积生存率显著低于CXCR6(-)的DLBCL患者(P=0.007),CXCL16/CXCR6共表达患者的平均累积生存率显著低于非共表达患者(P=0.008),提示CXCR6+以及CXCLI6/CXCR6共表达可能是影响生存率的因素。多因素COX逐步回归分析结果发现CXCL16/CXCR6共表达是影响预后的独立危险因素(RR=12.996,95%CI=1.727-97.377,P=0.013)。2.sCXCL16对DLBCL细胞生物学特性的影响及特点2.1研究方法CCK-8法检测细胞增殖能力;Transwell法检测细胞迁徙能力:流式细胞仪检测细胞周期情况;流式细胞仪检测细胞凋亡情况。2.2实验结果(1)单纯外源性添加sCXCL16对增殖、细胞周期、细胞凋亡的影响不显著。(2)外源性添加sCXCL16促进DLBCL细胞的迁徙(OCI-Ly3细胞:F=134.48,P=0.00;OCI-Ly8细胞:F=39.59,P=0.00;OCI-Ly10 F=85.43,P=0.00),且存在剂量效应,即sCXCL16浓度越高,诱导细胞迁移作用明显。(3)sCXCL16分别联合肿瘤微环境中常见的4种细胞因子,研究联合应用对DLBCL细胞生物学特征影响,结果发现:sCXCL16联合TNF-α或IFN-y对OCI-Ly1、OCI-Ly3 OCI-Ly8及OCI-Ly10细胞增殖均有协同抑制作用,抗CXCR6抗体可以部分拮抗此效应;而sCXCL16联合1L-3或IL-6未发现此生物学效应。(4)在OCI-Ly8及OCI-Ly10细胞,sCXCL16联合TNF-α对细胞周期作用不显著,无论是G1期、S期或者G2/M期,组间差异均无统计学意义(P>0.05)。(5)在OCI-Ly8及OCI-Ly10细胞,sCXCL16联合TNF-α能协同诱导细胞早期凋亡,与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05),抗CXCR6抗体能部分拮抗此效应;相对对照组,sCXCL16联合TNF-α可协同诱导以下凋亡通路蛋白的表达:含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase3,Capase3)、Capase8及Bcl-xl,而添加抗CXCR6能部分拮抗此效应。3.TNF-α联合sCXCL16协同抑制DLBCL增殖作用的机制3.1研究方法委托生物公司进行基因芯片筛查,检测sCXCL16和/或TNF-α单独及联合作用前后DLBCL细胞的基因表达差异。ELISA法检测sCXCL16对DLBCL细胞株释放TNF-α浓度的影响;Western bolt法检测sCXCL16对NF-Kb信号通路的激活效应;ELISA法检测抑制剂PDTC拮抗sCXCL16对DLBCL细胞株释放TNF-α的作用;WB法进行验证sCXCL16对TNFRSF12A表达的影响;CCK8方法检验PDTC及抗TNFRSF12A抗体拮抗sCXCL 16+TNF-α对DLBCL细胞增殖的协同抑制作用。3.2实验结果(1)委托生物公司进行全基因组表达谱芯片筛查,发现趋化因子受体通路基因差异表达,其中包括TNF受体家族的TNFRSF12A(FN14)基因;WB验证了外源性sCXCL 16能增加TNFRSF 12A蛋白表达。(2)外源性地添加sCXCL16能增加TNF-α浓度(OCI-Ly8:F=167.46,P=0.00,OCI-Ly10:F=94.49,P=0.00);外源性添加 NF-Kb 通路抑制剂 PDTC后部分抑制此效应。(3)WB结果显示外源性sCXCL16可诱导NF-Kb通路的中P-65(RelA)、RelC、P105/P50表达水平升高,但对Rel-B表达影响不明显。(4)同时加入PDTC及抗TNFRSF 12A抗体能拮抗sCXCL1 6+TNF-α对DLBCL细胞增殖的协同抑制作用,而单独添加两者拮抗效果不明显。4.sCXCL16参与DLBCL细胞与M1型巨噬细胞的相互作用4.1研究方法双染IHC及IF检测DLBCL组织中M1型巨噬细胞CXCR6的表达;IHC检测20例DLBCL组织中CD68及CXCL16的表达,分析CD68+细胞数量与CXCL16表达的相关性;使用贴壁法分离外周血来源的单核细胞,添加LPS及IFN-y诱导为M1型巨噬细胞;采用Tanswell方法检测sCXCL16对M1型巨噬细胞的趋化作用;采用间接共培法检测M1型巨噬细胞对肿瘤细胞的作用,检测以下指标:①CCK8方法检测下室活细胞OD值;②ELISA法检测共培养上清中的TNF-α及sCXCL16的浓度;③WB检测共培后肿瘤细胞凋亡通路蛋白的表达。4.2实验结果(1)经双染IHC及IF检测,观察到在DLBCL组织中,CD8+M1型巨噬细胞胞膜表达受体CXCR6;(2)DLBCL组织中CXCL16表达强度与CD68+细胞数量存正相关(r=0.813,P=0.000)。在Transwell下室加入外源性重组蛋白sCXCL16,对上室的M1型巨噬细胞具有趋化作用,这种趋化功能具有剂量依赖效应,即下室外源性添加的sCXCL16浓度越高,迁移的到下室的M1巨噬细胞数量越多。提示sCXCL16对M1型巨噬细胞具有趋化作用。(3)M1巨噬细胞与OCI-Ly8细胞及OCI-Ly10细胞进行间接共培,M1细胞对OCI-Ly8及OCI-Ly10细胞具有抑制增殖作用(vs.对照组,OCI-Ly8细胞:t=3.11,P=0.04;OCI-Ly10 细胞:t=16.86,P=0.00);共培液中 sCXCL16 及TNF-α浓度增高;共培后,肿瘤细胞的凋亡蛋白Capase3/8表达增高,提示共培通过增加TNF-a浓度诱导凋亡蛋白的表达,诱导细胞凋亡。5.DLBCL细胞sCXCL16的分泌调节5.1研究方法采用ELSIA方法检测DLBCL的细胞株上清液中sCXCL16浓度,采用WB检测DLBCL细胞株解整合素金属蛋白酶10(ADAM10)蛋白的表达,并分析两者关系;外源性分别加入4种细胞因子观察对DLBCL细胞株培养上清中sCXCL16浓度的影响。5.2实验结果(1)经检测,4株DLBCL细胞株均可分泌sCXCL16,组间差异具有统计学意义(F=24.706,P=0.000);4株细胞株均有ADAM10的表达,使用ImageJ软件对ADAM10的WB结果进行灰度值测定,统计分析发现ADAM 10表达灰度值与细胞分泌的sCXCL16浓度具有强相关(r=0.89,P=0.04),即ADAM10表达水平越高,sCXCL16的浓度越高。(2)加入IFN-y或TNF-α,能显著提高OCI-Ly8及OCI-Ly10细胞培养上清中sCXCL 16的浓度,而IL-3、IL-6则无此效应。进一步研究TNF-α影响sCXCL 16的机制,发现ADAM10抑制剂能拮抗TNF-α的这种效应,同时经WB检测,TNF-α能增加细胞中ADAM 10蛋白水平表达,表明TNF-α可通过诱导ADAM 10表达而促使培养上清sCXCL16浓度增高。结论1.CXCL16及其唯一的受体CXCR6在DLBCL组织及细胞株中高表达,CXCL16/CXCR6共表达是DLBCL预后不良的独立影响因素;2.sCXCL16对DLBCL细胞的增殖、凋亡和细胞周期影响不显著,但能促进DLBCL细胞的迁移;联合TNF-α作用可协同促进细胞的早期凋亡,该作用涉及凋亡通路蛋白caspase3/8等的活化。3.关于DLBCL细胞中sCXCL16的自分泌作用机制,发现sCXCL16可诱导DLBCL细胞TNF受体超家族中TNFRSF12A的表达,从而可能发挥与TNF-α协同促进肿瘤细胞凋亡的作用;sCXCL16还可以促使DLBCL肿瘤细胞产生TNF-α,机制涉及NF-κB通路的活化。4.DLBCL组织中M1型巨噬细胞的细胞表面表达CXCR6受体;可溶性CXCL16可以趋化M1型巨噬细胞;M1型巨噬细胞对DLBCL的相互作用包括:1)抑制DLBCL细胞增殖:2)促进TNF-α的分泌;3)激活DLBCL细胞凋亡通路,诱导细胞凋亡。5.DLBCL细胞株ADAM10的表达水平与培基上清中sCXCL16浓度具有正相关性;肿瘤微环境中的TNF-α可以通过DLBCL肿瘤细胞的ADAM10对sCXCL16浓度进行调控。创新之处:1.首次系统地阐明CXCL16/CXCR6在DLBCL中的表达及临床意义。2.体外系统观察了 DLBCL细胞sCXCL16的自分泌作用:发现了 sCXCL16联合TNF-α等对DLBCL增殖的协同抑制效应;发现了 sCXCL1 6诱导瘤细胞自分泌产生TNF-α,TNF-α通过诱导ADAM10表达从而增加上清中sCXCL16的浓度,形成自分泌环路效应;sCXCL16上调受体TNFRSF12A表达,为DLBCL临床治疗的可能靶点探寻提供了实验依据。3.较为系统的针对sCXCL16参与DLBCL瘤细胞与M1型巨噬细胞相互作用进行研究,提出并验证了肿瘤细胞通过分泌sCXCL16作用于巨噬细胞CXCR6,趋化M1巨噬细胞,M1型细胞分泌TNF-α,产生旁分泌环路的观点。