【摘 要】
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β-葡聚糖酶能够降解植物细胞壁中的β-葡聚糖,被广泛应用于啤酒加工、畜禽饲料、生物燃料生产及制糖工业中。在啤酒酿造过程中添加β-葡聚糖酶可显著降低麦汁的粘度,提高麦汁的滤出速度。在禽类饲料生产中,添加β-葡聚糖酶可以提高饲料利用率以及料肉转化率。目前国内已实现工业化生产的β-葡聚糖酶无法满足禽类饲料生产过程中耐受短时高温处理的要求。本文主要对黑曲霉来源的β-葡聚糖酶基因通过截短、在不同宿主中进行表
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β-葡聚糖酶能够降解植物细胞壁中的β-葡聚糖,被广泛应用于啤酒加工、畜禽饲料、生物燃料生产及制糖工业中。在啤酒酿造过程中添加β-葡聚糖酶可显著降低麦汁的粘度,提高麦汁的滤出速度。在禽类饲料生产中,添加β-葡聚糖酶可以提高饲料利用率以及料肉转化率。目前国内已实现工业化生产的β-葡聚糖酶无法满足禽类饲料生产过程中耐受短时高温处理的要求。本文主要对黑曲霉来源的β-葡聚糖酶基因通过截短、在不同宿主中进行表达、定点突变以及替换纤维素结合结构域来探索获得高耐热β-葡聚糖酶改性的方法,论文的主要结果如下:1)在巴斯德毕赤酵母酵母中表达了不同的eglA6截短基因,通过酶学性质分析发现PEj-3的酶学性显著优于其他截短体酶。其表观分子量为34 kDa,最适催化温度为75℃,最适催化pH在4.5左右。在水解大麦葡聚糖、地衣多糖、CMC-Na时PEj-3的比酶活分别为14956.2 U·mg-1、21758.4 U·mg-1、2057.6 U·mg-1。比同一宿主中表达的全长酶高出约20%。2)将性质最优的截短体酶分别在乳酸克鲁维酵母与毕赤酵母中表达,通过分析比较发现乳酸克鲁维酵母的表达产物PKj-3的酶学性质更佳。通过以大豆蛋白胨替代酪蛋白胨的方式延长产酶时间、大幅度提高了摇瓶发酵水平。在15 L发酵罐优化的发酵条件下,重组乳酸克鲁维酵母发酵84 h酶活达到517 U·mL-1。3)在理性设计的基础上对eglA6进行热稳定性改造,得到10个点单点突变体,其中T60S的最适催化温度达到了80℃,相较野生型提高了5℃。在80℃和85℃下的半衰期分别为134 min和74 min,是野生型的2.39倍和1.81倍。4)通过使用CBM 64家族的CBD与截短酶进行融合表达,在作用于不溶性底物,棉花、滤纸时,酶的催化活力较野生型分别提高了7.6、5.0倍,且能够微弱水解微晶纤维素。融合表达重组蛋白的最适催化pH与突变体酶相同,高温下的热稳定性略微提升。
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