第一部分胃癌干细胞的分选与鉴定,以及细胞中lncRNAROR的表达情况。背景:胃癌是一种在全世界范围内发病率位居第四位的恶性肿瘤,在我国肿瘤发病率中,胃癌位列第二,并且肿瘤死亡率中,胃癌位列第三,给人们的健康带来了很大威胁。胃癌具有术后转移、容易复发、耐药等特性,而且至今还没有研究出其调控机制,在这几年中,肿瘤发生发展的相关研究中,研究学者提出了肿瘤干细胞学说。该学说认为肿瘤起源于小部分具有自我更新和多种分化潜能的肿瘤细胞,这部分细胞称为肿瘤干细胞。目前,利用肿瘤干细胞表面特异的标记分子分离和纯化肿瘤干细胞的方法已较为普遍,并且有研究通过利用特异性的细胞表面标志分子CD133,使用流式细胞仪从胃癌中成功分选出胃癌干细胞,并证明了CD133是胃癌干细胞的表面标志物。目的:使用MKN-45细胞构建胃癌干细胞细胞系,并检测其中lncRNA ROR的功能。方法:人MKN-45胃癌细胞用RMPI1640培养液常规培养,制作单细胞悬液,调整细胞浓度后加入CD133-FITC抗体进行分选,孵育后使用流式细胞仪收集被CD133-FITC抗体标记的细胞,即为CD133+MKN-45细胞(简称CD133+);收集余下的未被CD133-FITC抗体标记的细胞,即为CD133-MKN-45细胞(简称CD133-)。并使用免疫荧光法检测CD133+细胞中CD133与CD44v8-10的共表达定位情况;之后使用实时定量PCR法和免疫印迹法检测CD133+和CD133-细胞中OCT4,SOX2和NANOG等肿瘤干细胞标记物的表达。之后,我们使用实时定量PCR法对CD133-和CD133+细胞中lncRNA ROR的表达进行检测,并取患者胃癌组织标本,分析其中lncRNA ROR和CD133表达量之间的关系。结果:免疫荧光法检测结果显示,分选得到的CD133+细胞表面标记物CD133与CD44v8-10有非常好的共定位,这提示我们分选得到的细胞为胃癌肿瘤干细胞;实时定量PCR法和免疫印迹法结果则显示,与CD133-细胞相比,CD133+细胞中肿瘤干细胞标记物OCT4,SOX2和NANOG等出现明显的高表达,这进一步验证了CD133+细胞具有肿瘤干细胞的特质。同时,CD133+细胞中lncRNAROR的表达量较CD133-显著增多,并且患者的组织标本分析也显示lncRNA ROR与CD133+二者表达量呈现显著的正相关。结论:通过流式细胞分选技术,我们使用MKN-45细胞成功构建了胃癌肿瘤干细胞细胞系CD133+,并且测定胃癌干细胞中lncRNA ROR表达显著增高。第二部分lncRNA ROR对胃癌干细胞增殖、侵袭和凋亡能力的影响背景:近年来,lncRNA的研究领域如火如荼,长度超过200个核苷酸的非编码RNA就称之为lncRNA。而该类lncRNA是非编码蛋白质,所以在原来的研究中很多人的观点是其为转录噪音。不过随着研究水平的提高,发现lncRNA不管是表观遗传、翻译水平、转录水平等各个层次中都能够对基因表达产生调控影响,同时在多种肿瘤中都有其身影。Loewer等人员还在研究中得出lncRNA ROR与一些干细胞的关键转录因子存在着相互作用,在干细胞的重编程过程中发挥重要作用。Dewi、Lagadec等研究则发现与诱导干细胞相似,肿瘤干细胞参与相同的重编程过程来维持肿瘤的生长。KLF4和SOX11这两个基因与肿瘤干细胞的功能有关联,并且这两个基因与lncRNA ROR密切相关,因此lncRNA ROR可能是胃癌干细胞一个新的治疗靶点。综上所述,探究lncRNA ROR在胃癌干细胞中的功能势在必行,这为将lncRNA ROR作为治疗靶点提供理论基础。目的:探究lncRNA ROR对胃癌干细胞增殖、侵袭和凋亡能力的影响。方法:为了更好的探究lncRNA ROR在胃癌干细胞中的功能,我们将成功建立了lncRNA ROR的过表达系统以及敲低系统。我们将该过表达质粒转染至CD133-细胞中,外源性过表达lncRNAROR;同时,将能够特异性抑制lncRNA ROR的siRNA转染至CD133+细胞中,敲低内源性lncRNA ROR的表达。然后,在两组中,我们使用MTT法和EdU掺入法检测改变lncRNA ROR表达对细胞增殖能力的影响。随后,在处理细胞24 h后,我们使用Transwel1法检测改变lncRNA ROR表达对细胞侵袭能力的影响。最后,我们利用流式细胞术使用Annexin V-FITC/PI双染法检测改变lncRNA ROR表达对细胞凋亡能力的影响。结果:MTT法、EdU掺入法、Transwell法以及流式细胞术检测结果显示,在CD133-细胞中过表达lncRNA ROR能够显著提高细胞的增殖和侵袭能力,但对细胞凋亡能力影响并不大。与此相反,在CD133+细胞中抑制内源性lncRNAROR则能够明显抑制细胞的增殖和侵袭能力,并且能够促进细胞的凋亡能力。结论:内源性lncRNA ROR对胃癌干细胞增殖、侵袭以及抑制凋亡能力至关重要。第三部分lncRNA ROR能够调控维持胃癌干细胞特性的转录因子的表达背景:研究结果显示,干细胞基因的表达不正常,和恶性肿瘤发生有密切关系。而且对于胃癌的出现、发展、复发、转移过程中都有关键性影响。干细胞转录因子会使得有关基因簇2(sexdeterminingregionY-box2,SOX2)表达不正常时,致使胃粘膜上皮细胞分化失衡紊乱,引发肿瘤出现;在细胞多能性的特点中,能够维持该功能的标志物是八聚体结合蛋白-4(octamerbindingfactor4,OCT4),该蛋白能够和细胞分化有密切关系;Nanog与体细胞实体瘤的关系也日益受到关注,NANOG具有激发肿瘤形成的干细胞样特性。因此,本研究以胃癌干细胞为研究对象,改变内源性lncRNA ROR表达后,探讨lncRNA ROR对维持胃癌干细胞特性的重要转录因子的作用,为胃癌的临床治疗和预后判断提供可能的参考依据。目的:探究lncRNA ROR对胃癌干细胞特性的影响。方法:我们将该过表达质粒转染至CD133-细胞中,外源性过表达lncRNAROR;同时,将能够特异性抑制lncRNA ROR的siRNA转染至CD133+细胞中,敲低内源性lncRNAROR的表达。然后,在两组中,我们使用实时定量PCR法和免疫印迹法检测维持胃癌干细胞特性的关键转录因子OCT4、SOX2和NANOG的表达水平。结果:实时定量PCR法和免疫印迹法检测结果显示,在CD133-细胞中过表达lncRNA ROR能够有效的上调OCT4、SOX2和NANOG的表达水平。与此相反,在CD133+细胞中抑制内源性lncRNA ROR则能够明显抑制OCT4、SOX2和NANOG的表达水平。结论:胃癌干细胞中,内源性lncRNA ROR的高表达能够通过上调OCT4、SOX2和NANOG等的表达水平,有效的维持胃癌干细胞特性。