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目的研究同型半胱氨酸(homocysteine, Hcy)对体外培养神经干细胞(neural stem cells, NSCs)增殖作用的影响,以及通过建立大脑中动脉栓塞(middle cerebral artrty occlusion, MCAO)模型,观察Hcy对局灶性脑缺血损伤大鼠神经干细胞增殖的作用,探讨Hcy基于DNA甲基化途径调控NSCs增殖的作用机制。方法采用无血清培养原代培养新生大鼠NSCs,将细胞随机分成4组：正常对照组(培养液中添加Hcy0μmol/l, Hcy-C组)、Hey低剂量组(培养液中添加Hey30μmol/l, Hcy-L组)、Hcy中剂量组(培养液中添加Hey300μmol/l, Hcy-M组)、Hcy高剂量组(培养液中添加Hey1mmol/l,Hcy-H组,)。采用Cell Dimension软件对神经球直径进行测量；采用免疫荧光(Immunofluorescent, IF)检测NSCs标记物Brdu和Sox2的表达：采用乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)测定试剂盒检测不同浓度Hcy作用下培养液中LDH的活力；采用DNA甲基化定量试剂盒检测不同Hcy浓度下细胞总甲基化水平；采用甲基转移酶活性检测试剂盒检测DNMTs总活性以及Western Blot检测DNA甲基转移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)的蛋白表达；采用高效液相法(HPLC)检测细胞内S-腺苷甲硫氨酸(s-adenosylmethionine, SAM)、S-腺苷同型半胱氨酸(s-adenosylhomocysteine, SAH)的水平。成年雄性SD(sprague-nawley)大鼠随机分假手术组(sham operation group, SO组)、大脑中动脉栓塞模型(middle cerebral artery occlusion group, MCAO组)以及大脑中动脉栓塞模型+同型半胱氨酸(middle cerebral artery occlusion+Hcy group, MCAO+Hcy组)3组。SO组和MCAO组腹腔注射生理盐水5ml/kg·bw·d, MCAO+Hcy组腹腔注射2%Hcy溶液5ml/kg·bw·d,注射28d。通过Morris水迷宫实验检测大鼠的空间学习记忆能力；采用免疫组化法以及Western blot检测Sox2蛋白的表达；采用DNA甲基化定量试剂盒检测总甲基化水平；采用甲基转移酶活性检测试剂盒检测DNMTs总活性；采用Western Blot检测DNA甲基转移酶的蛋白表达。采用高效液相法(HPLC)检测大鼠血浆内Hey、SAM、SAH的水平。结果用无血清培养原代培养新生大鼠NSCs6d后,细胞聚集成球形团块,呈悬浮状态,Hcy添加组细胞神经球直径较对照组小,且差异均有统计学意义(P<0.05)。Brdu和Sox2经免疫荧光双标记法鉴定均呈双阳性表达,Hcy添加组Brdu/Sox2双标阳性率较对照组小,且差异均有统计学意义(P<0.05)。经LDH测定试剂盒检测,Hcy添加组细胞培养液中LDH活性较对照组升高,且差异均有统计学意义(P<0.05)。DNA总甲基化水平检测结果显示：与对照组相比,Hey添加组细胞总甲基化水平降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。DNMTs总活性检测结果显示：与对照组相比,Hcy添加组较对照组DNMTs总活性均下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。Western Blot结果显示,与对照组相比,Hcy添加组DNMT1蛋白表达均下降,差异均有统计学意义(P<0.05),Hcy-H组较Hcy-L组和Hcy-M组DNMT1蛋白表达下降,差异均有统计学意义(P<0.05)；与对照组和Hcy-L组相比,Hcy-M组和Hcy-H组DNMT3a蛋白表达均下降,差异均有统计学意义(P<0.05)；与对照组和Hcy-L组相比,Hcy-M组和Hcy-H组DNMT3b蛋白表达均下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。HPLC检测结果显示：与对照组和Hcy-L组相比,Hcy-M组和Hcy-H组SAH的水平升高,差异均有统计学意义(P<0.05)；与对照组和Hcy-L组相比,Hcy-M组和Hcy-H组SAM/SAH比值降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。腹腔注射及造模成功后Morris水迷宫实验显示,与MCAO组相比,MCAO+Hcy组大鼠逃避潜伏期明显缩短,差异均有统计学意义(P<0.05)；与MCAO组相比,及MCAO+Hcy组单位时间内穿越平台区域次数明显减少,差异均有统计学意义(P<0.05)。DNA,总甲基化水平检测结果显示：与MCAO组相比,MCAO+Hcy组总甲基化水平下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。经免疫组化及Western blot检测：与MCAO组相比,MCAO+Hcy组Sox2蛋白表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。DNMTs,总活性检测结果显示：与MCAO组相比,MCAO+Hcy组Sox2蛋白表达降低DNMTs活性下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。Western blot结果显示：与MCAO组相比,MCAO+Hcy组DNMT1、 DNMT3a蛋白表达降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。经HPLC检测显示,与SO组及MCAO组相比,MCAO+Hcy组Hcy浓度下降,差异均有统计学意义(P<0.05)；与SO组及MCAO组相比,MCAO+Hcy组SAM/SAH比值下降,差异均有统计学意义(P<0.05)。免疫荧光染色结果显示,Sox2呈阳性表达,且MCAO+Hcy组表达较SO组及MCAO组降低,差异均有统计学意义(P<0.05)。结论本实验成功的分离培养大鼠新生鼠NSCs以及建立大鼠大脑中动脉栓塞模型。Hcy抑制NSCs的增殖其机制可能是：Hcy通过改变甲基化途径中关键代谢物SAH的浓度,降低SAM/SAH的比值,同时降低甲基化转移酶的活性及蛋白的表达,抑制了甲基化反应的发生,进而抑制了NSCs的增殖。