论文部分内容阅读
中枢神经系统脑血管障碍是一种常见的严重疾病,血栓形成可能导致局部缺血或血管破裂出血,往往引起神经功能缺陷。这是最常见的致命神经系统疾病,也是长期致残的首要疾病,许多幸存者留下了不可逆的神经功能障碍如偏瘫、失语、共济失调等。大脑局部血栓、心源性栓塞或脑血管中的动脉粥样硬化软斑块导致血液供应中断引起缺血性脑中风约占脑血管疾病的80%,目前唯一经FDA批准的用于中风患者溶栓的药物是重组组织纤溶酶原激活剂,在中风3小时以内用来溶解血栓、恢复血液的供应。溶栓治疗受时间限制并且实现血栓溶解血液循环可增加颅内出血的风险,血液重新进入缺血组织可能会启动再灌注的损伤。对于减少再灌注损伤和缺血引起的神经功能缺陷都没有有效的治疗手段,因此寻找能够治疗减轻缺血再灌注损伤以及促进神经功能恢复的药物具有广阔的应用前景。12-氧-十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate,TPA)即佛波酯,是一种高效的蛋白激酶C(Protein Kinase C,PKC)激活剂,蛋白激酶C(PKC)是由丝氨酸/苏氨酸组成的至少有12种同工酶的蛋白激酶家族。TPA通过激活PKC参与大脑中必需的信号网络和细胞信号的传导,调节细胞功能广泛并涉及多种疾病状态,包括细胞生长、分化、凋亡、突触功能、记忆、行为、认知及再灌注损伤。有文献报道在大鼠局灶性脑缺血再灌注前60 min或后30min单次给予200μg/kg,24 h后能够降低脑水肿程度,减轻脑损伤。但是TPA 200μg/kg剂量远超出一期临床可接受的安全剂量,因此本实验探讨在大鼠局灶性脑缺血再灌注中给予临床安全剂量的TPA治疗后是否对脑梗死和水肿具有保护作用以及对神经功能恢复的影响。实验目的探讨TPA对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤引起的脑梗死和脑水肿是否具有改善作用及保护作用的机制研究。实验方法1 TPA对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤72 h后的保护作用用66只雄性SD大鼠,体重250-280 g,随机分为6组,分别为假手术组、模型组和TPA四个剂量组(12.5,25,50,100μg/kg),用改良的线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞(middle cerebral artery occlusion,MCAO)局灶性脑缺血2小时再灌注损伤模型,再灌注前1h第一次尾静脉注射TPA,之后每天给药一次,连续给药3天,假手术组和模型组尾静脉注射相同浓度的TPA对照溶剂。手术后24h进行平面上行为学评分排除失败的大鼠模型,再灌注72h后再次平面上行为学评分,然后将大鼠吸入七氟烷麻醉断头取脑,进行2,3,5-三苯基氯化四氮唑(2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride,TTC)染色,用Photoshop软件处理并计算大鼠脑梗死和脑水肿体积。2 TPA对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤10天后神经功能恢复的影响用20只SD雄性大鼠随机分为假手术组、模型组和TPA 25μg/kg组,用改良的线栓法建立大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)局灶性脑缺血2小时再灌注损伤模型,再灌注前1h尾静脉注射TPA,之后每天给药一次,连续给药3天,间隔2天,再连续给药5天并同时腹腔注射5-溴-2-脱氧尿苷(5-Bromo-2′-deoxyuridine,Brd U)50 mg/kg,假手术组和模型组尾静脉注射等浓度的TPA对照溶剂。手术后24小时进行平面上行为学评分排除失败大鼠模型,每天记录体重,在2、4、6、8、10天进行综合神经功能(平衡木行走和平面上行为)评分,第10天取脑,脑组织做HE染色,观察脑组织病理的改变,免疫组化检测Neu N的表达,免疫荧光检测GFAP、BDNF、Brd U-DCX的表达。结果1.TPA对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤72 h后的保护作用1.1.行为学评分结果:大鼠脑缺血再灌注72 h后,模型组平面上行为学评分3.44±0.73,TPA(12.5,25,50,100μg/kg)四个剂量组在脑缺血再灌注72h后平面上行为学评分分别为3.50±0.71、1.80±1.00、2.33±1.11、2.10±1.52。与模型组相比,TPA(25,50,100μg/kg)评分显著降低(P<0.01,P<0.01,P<0.01),表明TPA能够改善损伤引起的行为学障碍。1.2.TTC染色结果:大鼠脑缺血再灌注72 h后,TTC染色结果显示,模型组脑梗死体积为41.95%,TPA(12.5,25,50,100μg/kg)四组在脑缺血再灌72 h后脑梗死体积分别为45.74%、22.68%、26.91%、26.15%,与模型组相比,TPA(25,50,100μg/kg)三个剂量组脑梗死体积显著减小(P<0.01,P<0.01,P<0.01)。模型组脑水肿体积15.8%,TPA(12.5,25,50,100μg/kg)四组在脑缺血再灌注72 h后脑水肿体积分别为6.35%、1.98%、7.58%、8.41%;与模型组相比,TPA(12.5,25,50,100μg/kg)脑水肿体积显著减小(P<0.01,P<0.01,P<0.01,P<0.01),TPA 25μg/kg剂量组对脑水肿减小程度显著优于TPA 100μg/kg剂量组(P<0.05)。2.TPA对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤10天后神经功能恢复的影响2.1.大鼠一般生存状况:大鼠在缺血再灌注手术后毛色暗黄、进食饮水量减少、体重降低,活动减少。假手术组初始体重266.7±4.85 g,第3天体重降到最低水平242.6±8.77 g,之后逐渐恢复,到第10天体重为276.9±12.05 g,达到术前体重;模型组初始体重266.4±3.14 g,再灌注第5天体重降到最低水平210.6±17.33 g;TPA给药组初始体重266.8±5.35 g,第5天体重降到216.7±19.52 g,之后体重回升,两组之间每天体重无显著差异,但低于假手术组(P<0.05)。2.2.神经功能综合评分:模型组大鼠2、4、6、8、10天综合评分分别为6.83±3.90、5.67±3.76、2.17±3.18、1.00±1.67、0.33±1.03,TPA组大鼠2、4、6、8、10天综合评分分别为6.29±2.56、3.43±2.13,1.71±1.29,0.86±1.32,0.57±0.91,神经功能缺陷逐渐恢复。与模型组相比,TPA给药组神经功能综合评分在第4天显著降低(P<0.05),表明TPA治疗后神经功能恢复较快。2.3.HE染色结果:假手术组正常大脑组织无损伤区域,神经纤维、细胞核排列均匀。模型组大鼠脑缺血梗死区域较大,有空泡组织形成,坏死脑组织稀疏,且出现坏死细胞,细胞核固缩、细胞核染色加深、核溶解及核消失;TPA组大鼠脑缺血损伤区域较小,且出现细胞核固缩聚集,部分区域充满巨噬细胞和炎症细胞聚集浸润现象。2.4.Neu N免疫组化结果:假手术组大鼠正常脑组织阳性神经元细胞数目占67.08%,模型组和TPA组梗死半暗带阳性细胞数目分别占29.01%和61.64%,与模型组相比,TPA组半暗带阳性神经元数目较多(P<0.05);结果表明TPA治疗可显著降低损伤期间神经元细胞死亡率。2.5.GFAP免疫荧光染色结果:模型组和TPA组的梗死区脑组织GFAP的表达为32.65±3.59和48.14±4.30,均高于对侧GFAP的表达20.66±3.60,39.87±1.24(P<0.01,P<0.01),TPA 25μg/kg组梗死同侧和对侧的脑组织中的GFAP表达均高于模型组(P<0.01,P<0.01);结果表明梗死发生过程和TPA治疗能够促进星形胶质细胞的活化。2.6.BDNF免疫荧光染色结果:模型组梗死同侧和对侧BDNF表达分别为23.06±3.54,27.13±1.08,TPA组同侧和对侧脑组织中BDNF的表达分别为37.60±4.19和31.82±2.49,显著高于模型组(P<0.01,P<0.01)。表明TPA能够增加脑中BDNF的表达,提供神经营养。2.7.Brd U-DCX免疫荧光双染色结果:在脑梗死半暗带上,模型组Brd U-DCX的表达为14.75±3.43,TPA组27.88±5.19,TPA组显著高于模型组(P<0.01);TPA组大脑皮质区、脑室下区和纹状体Brd U-DCX的表达分别为41.26±7.68、52.98±18.75和20.20±5.52,大脑皮质区和脑室下区Brd U-DCX的表达显著高于纹状体(P<0.05,P<0.05)。表明TPA可以促进阳性新生神经元的分化。结论大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤过程中,给予TPA治疗能够减轻缺血再灌注损伤,可能与减少神经元的死亡、促进脑源性神经营养因子产生有关。