IFN-γ-KLF4-PD-L1轴在调节HP感染相关胃癌免疫逃逸中的作用和分子机制

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【研究背景】胃癌是全球常见的恶性肿瘤之一,位居全世界肿瘤致死人数第二位。大量的研究表明,HP(Helicobacter pylori)感染促进胃癌的恶性进展和转移复发,这可能与HP感染的持续存在,造成局部免疫抑制微环境,使胃癌细胞逃脱机体的免疫监视有关。因此进一步探讨胃癌细胞逃逸机体抗肿瘤免疫的分子机制是当前胃癌研究工作的热点和重点。PD-L1(Programmed death-ligand 1)是近年来迅速发展的免疫检查点治疗的关键成员,是PD-1(Programmed death 1)的受体,在许多类型细胞中表达,多种肿瘤细胞通过高表达PD-L1而活化PD-L1/PD-1信号途径,抑制T细胞的活化和细胞因子的产生,逃逸机体的免疫监视。然而在机体抗肿瘤免疫应答过程中调节PD-L1表达最关键的刺激因子是IFN-γ(Interferon-gamma)。IFN-γ是一种具有双重调节作用的多功能细胞因子,一方面可通过诱导T辅助细胞1(T helper cell 1,Th1)分化,细胞毒性T淋巴细胞(Cytotoxic T lymphocytes,CTL),树突细胞(Dendritic cell,DC)活化而发挥抗肿瘤免疫活动,另一方面又通过上调肿瘤细胞PD-L1的表达使肿瘤细胞逃脱T细胞免疫攻击,促进肿瘤恶性进展。由于细胞毒性相关抗原蛋白(Cytotoxin-associated gene A protein,CagA)是HP最重要的致癌蛋白之一,本课题组初步实验结果发现转染CagA模拟HP感染至胃上皮GES-1细胞中使KLF4(Krüppel-like factor 4)在mRNA和蛋白水平表达均降低。KLF4是我们实验室一直研究的一种转录因子,我们前期实验结果发现它在胃癌细胞中表达降低或消失,在胃癌组织中表达也降低,它具有抑制肿瘤的作用,很多文献也报道KLF4参与机体的免疫反应。同时有文献报道,KLF4是IFN-γ的下游靶基因。于是我们进行了初步实验发现,胃癌组织中KLF4表达下调,PD-L1在胃癌组织中高表达,且通过生物信息学分析发现PD-L1启动子区含有2个KLF4结合位点,提示我们KLF4和PD-L1之间可能存在负调控关系。且发现在胃癌细胞中加入IFN-γ处理上调PD-L1表达,但在KLF4杂合性缺失的SK-GT5细胞中PD-L1上调更显著,提示我们KLF4的功能状态对于IFN-γ调控PD-L1表达的影响。同时转染不同剂量的CagA也明显上调PD-L1的表达,提示我们HP感染或CagA转染对于PD-L1表达的影响。根据预实验结果,我们提出假说,在HP感染的早期,KLF4基因功能正常,HP感染伴随的IFN-γ升高可通过上调KLF4的表达来发挥抗肿瘤免疫活动,随着HP感染的持续存在,HP感染伴随的IFN-γ无法通过上调KLF4的表达来发挥抗肿瘤作用反而通过上调PD-L1表达使肿瘤细胞逃脱T细胞免疫攻击,促进胃癌的恶性进展。KLF4在胃癌细胞内的低表达和消失是否与胃癌细胞逃脱免疫监视有关,KLF4在胃癌细胞中的表达降低与PD-L1的高表达是否有关。因此我们带着以上问题设计实验进行验证。【研究方法】1.WB检测正常胃黏膜上皮细胞GES-1和三株胃癌细胞AGS,SGC-7901,SK-GT5的KLF4与PD-L1基础表达水平。2.IFN-γ处理AGS细胞24小时,检测KLF4与PD-L1表达。3.50ng/ml IFN-γ分别在0h,2h,4h,6h,12h,24h处理GES-1、AGS细胞,检测KLF4、PD-L1表达。4.50ng/ml IFN-γ处理GES-1,GES-1 KLF4 KO,AGS,SGC-7901细胞,分别在蛋白水平和mRNA水平检测KLF4以及PD-L1的表达。5.GES-1,AGS细胞转染KLF4 SiRNA后,用WB、qRT-PCR检测PD-L1表达。6.GES-1细胞转染KLF4 SiRNA后加入IFN-γ处理,WB、qRT-PCR检测PD-L1表达。7.SK-GT5,MGC-803细胞中转染外源性的KLF4质粒,WB检测KLF4,PD-L1表达。8.HP与AGS按照50:1,100:1,150:1感染复数共培养,WB检测KLF4,PD-L1表达;AGS,MGC-803细胞转染CagA质粒,WB、RT-PCR检测KLF4,PD-L1表达。9.将KLF4质粒,STAT3质粒分别与PD-L1启动子质粒、突变体报告质粒共转染,通过双荧光素酶报告基因检测PD-L1启动子荧光素酶活性以及KLF4对PD-L1的调节作用。10.50ng/ml IFN-γ处理GES-1,AGS细胞,WB检测STAT1,STAT3磷酸化水平。【研究结果】1.KLF4在正常胃上皮GES-1中表达较高,在胃癌细胞中表达较低,而PD-L1在胃癌细胞中表达较高,KLF4与PD-L1的表达成负相关。2.IFN-γ处理AGS细胞24h发现在50ng/ml时PD-L1表达较高。3.不同时间点IFN-γ处理发现在24h时PD-L1升高明显。4.50ng/ml干扰素处理GES-1和GES-1 KLF4 KO细胞24h后,KLF4和PD-L1表达均有所升高,但PD-L1在GES-1 KLF4 KO细胞中IFN-γ处理上调更加显著。IFN-γ处理AGS和SGC-7901也得到相同的结果,提示我们KLF4与PD-L1的调控关系。5.GES-1,AGS转染KLF4 SiRNA后PD-L1在蛋白水平和mRNA均表达上调,进一步证实KLF4在转录水平负调控PD-L1的表达。6.GES-1细胞转染KLF4 SiRNA后用IFN-γ处理,PD-L1在蛋白水平和mRNA水平均有所上调,进一步提示KLF4的状态对于IFN-γ调节PD-L1表达的影响。7.外源性的KLF4转染至SK-GT5,MGC-803细胞也明显降低PD-L1的表达。8.不同感染复数的CagA~+的HP与AGS共培养,结果发现随着感染复数的增加,KLF4表达逐渐降低,而PD-L1表达逐渐上升;同时转染CagA质粒至AGS、MGC-803细胞中使KLF4在蛋白水平和mRNA水平表达均降低,而PD-L1相反,CagA转染后均有所上调。9.KLF4表达载体和PD-L1启动子荧光素报告载体共转染AGS细胞发现KLF4可明显抑制PD-L1启动子活性;STAT3表达载体和PD-L1启动子荧光素报告载体共转染AGS细胞发现STAT3可明显上调PD-L1启动子活性。因此PD-L1是KLF4,STAT3的下游靶基因。KLF4负调控PD-L1的表达,STAT3上调PD-L1表达在许多文献也已报道。10.IFN-γ处理GES-1,AGS细胞后,STAT1,STAT3磷酸化水平均升高,进一步提示我们在胃癌细胞中IFN-γ可通过STAT1,STAT3通路诱导PD-L1表达。【结论】1.HP感染/CagA转染导致PD-L1表达升高;2.KLF4通过转录水平负调控PD-L1的表达;3.HP感染/CagA转染导致KLF4表达降低,引起PD-L1表达升高,导致局部免疫抑制微环境,从而可能促进胃癌细胞的免疫逃逸。
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