前体RNA剪接(pre-mRNA splicing，简称RNA剪接)将转录产物中的内含子移除，外显子拼接在一起，是形成成熟RNA的重要步骤。RNA剪接由剪接体催化完成，剪接体组装是一个复杂动态的过程，涉及到五种snRNA和超过150种蛋白。内含子中除了5和3剪接位点外，还包含剪接支点区域(BS)与多聚嘧啶区等剪接信号。剪接体组装的各个步骤对这些剪接信号的正确识别与校对是剪接得以顺利进行的必要条件。同属于DExD/H-box蛋白家族的8个ATP水解酶（又称RNA解旋酶）为剪接体组装与催化所必需，芽殖酵母系统中的研究表明它们在动态构象变化，剪接信号识别和校正过程中发挥重要功能。其中，Prp5与早期剪接体中多种蛋白和RNA组分存在相互作用，在预剪接体（U1/U2/pre-mRNA）形成阶段连接U1和U2snRNP。并且Prp5的活性（主要是ATP水解速度）与作用底物BS∶U2snRNA的双链稳定性存在竞争关系，起到校对剪接支点区域序列，维持剪接保真性的作用。　　蛋白质翻译后修饰存在于大多数真核生物中，可以影响蛋白因子的稳定性与功能，是信号传导途径中一种重要的调控方式，其中磷酸化最为广泛。已知一些剪接因子可以通过磷酸化状态的变化参与调控RNA剪接。随着生物进化，高等生物内含子的剪接支点区域序列趋向多样化，导致BS∶U2snRNA的双链稳定性降低，对Prp5的校对能力提出挑战。Prp5是否通过翻译后修饰调节自身活力，从而参与剪接支点区域保真性的调控，是本论文试图解答的问题。　　本论文主要采用CRISPR-Cas9技术构建相应的HEK293T(以下简称为293T)细胞系，质谱鉴定和实验确定了hPrp5的磷酸化位点，通过高通量测序研究分析第804位丝氨酸(S804)突变为丙氨酸后RNA剪接的变化，探究该位点磷酸化调控RNA剪接的机制。并初步对上游调控信号进行了探索。　　主要取得了如下研究结果:　　1)利用CRISPR-Cas9技术，在293T细胞中V5标记内源hPrp5，通过免疫共沉淀与质谱技术鉴定，获得了包括磷酸化在内的多个hPrp5的翻译后修饰位点，同时还鉴定了人类剪接体中hPrp5的相互作用蛋白。　　2)选择磷酸化程度最高的S804位点作为研究对象，制备了特异性的磷酸化抗体，通过碱性磷酸酶处理和突变体实验证明了该位点磷酸化的真实性，并研究了hPrp5-S804A突变体对报告基因剪接的影响。　　3)利用CRISPR-Cas9技术构建了hPrp5-S804A突变细胞系，发现804位点的持续非磷酸化并不影响蛋白的稳定性和细胞定位。通过进一步的转录组测序分析发现细胞中大量的选择性剪接事件发生变化。相对于野生型，突变体细胞系中外显子跳读(exon skipping)和内含子保留(intron retention)程度加重的事件在所有变化类型中所占比例最高，分别为59.46％和15.36％，说明S804A突变导致剪接效率下降，即S804位点的磷酸化促进了这些RNA剪接的发生。　　4)通过选择性剪接事件验证和hPrp5蛋白的竞争回补实验，分析其中成功验证的外显子跳读事件，发现其上下游内含子的5和3剪接位点强度没有明显差别，但剪接支点区域强度差异明显。hPrp5-S804A突变改变了具有弱剪接支点区域内含子的剪接效率，从而导致中间外显子的跳读程度发生变化。初步揭示了S804位点磷酸化调控选择性剪接发生的机制。　　5)体外实验显示磷酸酶处理的hPrp5不能被S804磷酸化抗体识别，但再经蛋白激酶CK2处理后恢复识别，揭示CK2可能是S804磷酸化的上游激酶。　　综上所述，本论文鉴定了人类293T细胞中剪接因子hPrp5的翻译后修饰位点和相互作用蛋白，在转录组水平检测了其S804磷酸化位点突变对选择性剪接的影响，并初步研究了该影响机制和磷酸化S804位点的上游修饰激酶。这些研究结果为进一步深入开展高等生物中各种信号传导通路对剪接体组分的修饰，和随之的RNA剪接精细调控研究提供了新的思路。