坦布苏病毒(Tembusu Virus,TMUV)感染是由TMUV引起的一种新发传染性疾病。该病自2010年起持续危害我国水禽养殖业,造成严重经济损失。长链非编码RNA(long non-coding RNA,1ncRNA)是一类长度大于200个核苷酸,缺乏编码能力的RNA,最近大量研究报道其具有多种生物学功能,在病毒感染过程中发挥着重要的调控作用。为探究lncRNA在TMUV感染中的可能作用,本研究以鸭胚成纤维细胞(duck embryo fibroblast cells,DEFs)为试验材料,利用高通量RNA测序(RNA-Seq)技术揭示TMUV感染诱导的lncRNA表达谱变化,通过生物信息学手段预测差异表达1ncRNA的生物学功能,并对筛选的差异表达1ncRNA进行表达验证和初步的功能研究。主要内容如下:1、为探讨TMUV感染DEFs后病毒的复制情况与宿主细胞的生物学特性变化,本研究利用DEFs为研究对象,分别接种3 MOI的TMUV,并在l2 hpi,24 hpi和48 hpi检测病毒复制、细胞周期和细胞凋亡三个生物学指标。结果表明,随着病毒感染时间的延长,细胞中的病毒滴度逐渐上升,且病毒在24~48 hpi急剧复制。细胞在12 hpi和24 hpi都出现S期和G2M期的停滞。此外,细胞在病毒感染的各个时间点,都出现显著的细胞凋亡现象,并且随着感染时间的延长,凋亡细胞的比例逐渐增大。2、为了探索lncRNA在TMUV感染中的生物学功能,本研究基于细胞生物学的检测结果选取12 hpi和24 hpi两个时间点,利用RNA-Seq技术对感染的DEFs进行测序。通过数据分析表明,在12 hpi和24 hpi分别获得34条和339条差异表达lncRNA。为进一步探索lncRNA在TMUV感染过程中的功能,利用生物信息学预测了差异表达lncRNA的顺式调控靶基因,然后对靶基因进行GO功能富集分析和KEGG信号通路富集分析。结果显示,差异表达lncRNA的靶基因主要富集在生物调控、细胞进程、代谢进程、单细胞进程、细胞、细胞组分和细胞器等GO功能条目以及免疫系统、内分泌系统、信号转导和信号分子与交互等KEGG信号通路条目。3、为了验证RNA-Seq数据的可靠性,本研究在12 hpi和24 hpi分别筛选4条和11条差异表达的lncRNA,采用荧光定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)的方法检验了筛选lncRNA的差异表达。结果表明,RT-qPCR的结果与RNA-Seq的数据基本一致。此外,相关性分析显示,两种方法检测lncRNA差异表达的相关性是0.8769(P<0.0001)。以上试验说明RNA-Seq的数据是准确可靠的,可以用作后续的功能研究。4、为进一步探索lncRNA在TMUV感染过程中的生物学功能,本研究筛选lncRNA8505.2进行后续的功能研究。本研究采用基因重组的方法构建lncRNA8505.2的cDNA序列真核表达载体,在HEK293细胞中过表达lncRNA8505.2后接种3 MOI的TMUV,在12 hpi,24 hpi和36 hpi检测细胞中的病毒复制情况。结果表明,lncRNA8505.2在36 hpi显著抑制TMUV的复制,而在12 hpi和24 hpi抑制作用不显著。为了研究lncRNA8505.2抑制TMUV复制的作用机制,本研究同时检测细胞中I型干扰素(I-IFN),人黏病毒抵抗蛋白(MX1)和趋化因子(C-X-C基序)配体(CXCL10)等天然免疫相关基因的转录水平。结果显示,这些天然免疫相关基因的转录水平没有显著升高。以上研究表明,lncRNA8505.2可以抑制TMUV复制,但是这种抑制作用不是通过增强这些天然免疫因子的转录水平实现的。