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Gtl2基因位于小鼠12号染色体末端的Dlk1-Dio3印记区间,其转录的长非编码RNA Gtl2对胚胎发育和肿瘤发生都具有重要功能。本实验室前期对小鼠早期胚胎的研究发现,Gtl2于桑葚胚期开始表达,并最终特异性定位于囊胚内细胞团(ICM)。功能研究表明,干扰Gtl2的表达虽然不影响囊胚发育率,但会影响囊胚的孵化(hatching)、体外生长(outgrowth)和内细胞团(ICM)的形成。进一步研究发现,Gtl2的表达下调导致囊胚ICM特异性转录因子Oct4的表达下降,提示Gtl2很可能通过影响Oct4而发挥作用。前期实验已经证实,Gtl2可能作为ceRNA(competing endogenous RNA)通过miRNA途径调控Oct4的表达,从而在早期胚胎中发挥作用。因此,本课题旨在筛选可能与Gtl2结合并调控Oct4的候选miRNA,并揭示Gtl2在小鼠早期胚胎中调控Oct4可能的分子机制。首先,利用生物信息学网站工具并结合已发表的论文,我们筛选出既能与Gtl2有潜在结合能力又被实验证实可以下调Oct4的候选miRNAs:let-7c(2个结合位点)、miR-24、miR-29a、miR-31和miR-135b。进而通过双荧光素酶报告系统证实,let-7c的两个结合位点都与Gtl2具有显著的结合能力,而miR-24、miR-29a和miR-135b也能与Gtl2发生结合,只有miR-31未检测到与Gtl2的结合。因此,我们将let-7c、miR-24、miR-29a、和miR-135b作为候选miRNA进行下一步研究。在细胞水平,我们利用Gtl2高表达的MLTC-1细胞(小鼠睾丸间质细胞瘤细胞)验证候选miRNAs与内源Gtl2的相互作用,结果表明只有let-7c与内源Gtl2存在明显的结合。我们又利用另一种表达Gtl2的N2a细胞(小鼠神经母细胞瘤细胞),进一步证实let-7c与内源性Gtl2存在相互作用。因此,我们将let-7c作为最终候选miRNA,在胚胎水平进行进一步验证。在胚胎水平,我们通过挽救实验(rescue)证实,Gtl2能够挽救let-7c过表达所导致的囊胚体外生长过程中的ICM缺失,提高Oct4的表达水平,从而恢复胚胎的发育能力。说明Gtl2可以在早期胚胎内与let-7c发生相互作用,通过let-7c影响Oct4的表达,进而在早期胚胎中调控ICM的形成。综上所述,本课题筛选得到了与Gtl2结合并调控Oct4表达的候选miRNAs,并在细胞水平证实let-7c与内源Gtl2具有结合能力,进而在胚胎水平初步阐明了let-7c介导Gtl2调控Oct4的分子机制。此论文的研究成果,为深入理解Gtl2对早期胚胎发育及ICM的形成和分化机制奠定基础,为胚胎干细胞(ESC)和诱导多能干细胞(iPSC)等相关研究提供理论依据和参考。