研究背景 心肌再生能力低下是心肌梗死(MI)后多种治疗方法效果不佳的主要原因。虽然一些研究证实了骨髓间充质干细胞(MSCs)移植治疗MI有效,但是心功能改善十分有限。其中移植细胞归巢率低是其疗效不佳的主要原因。因此提高移植细胞归巢能力是改善MSCs移植疗效的关键因素之一。将细胞移植与基因治疗相结合,用促进归巢的基因修饰MSCs,使其高表达,增加MSCs向MI局部的归巢效应,是可能策略之一。整合素连接激酶(ILK)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在正常心肌细胞中有较高表达。ILK通过激酶区与整合素β1胞浆区结合,与细胞归巢关键分子密切相关。我们的前期研究发现ILK基因可以调节细胞生长、存活、增殖及分化。但ILK对MSCs归巢的作用尚不清楚。因此,本项目拟用SPIO标记ILK基因转染的MSCs,建立猪MI模型后进行移植治疗,应用MR动态观察移植细胞向缺血心肌迁移、归巢的变化及对心功能的影响。本项目有望为提高MI细胞治疗疗效提供新的理论和科学依据。研究方法 1、以表达ILK及绿色荧光蛋白GFP(ad-GFP/ILK)或仅表达GFP(ad-GFP)的腺病毒载体转染体外培养的猪MSCs,确认转染成功后,观察体外高表达ILK基因对MSCs的细胞活力、增殖能力、迁移能力及细胞凋亡的影响;2、用超小超顺磁性纳米氧化铁颗粒(USPIO)标记MSCs,体外MR检查,并检验USPIO标记对MSCs的细胞活力、增殖能力、迁移能力及细胞凋亡的影响;3、经冠脉球囊封堵方法构建猪心肌梗死模型,一周后再次经冠脉随机移植ILK-MSCs、MSCs(均为5×107细胞)或PBS,移植后24h、3天、1周及2周进行MR分子影像学检查,观察移植细胞归巢情况;心肌首过灌注成像观察局部心肌血流灌注情况;延迟增强观察梗死心肌面积;心脏电影成像观察局部心脏功能状态;2周后冰冻切片观察GFP表达情况;普鲁士蓝染色观察细胞内铁的分布;HE染色观察梗死心脏形态;Masson染色检测纤维化程度;Ki67染色观察细胞增殖情况;CD31及vWF染色观察血管新生情况;Caspase3染色检测细胞凋亡情况。4、统计学处理应用SPSS17.0统计软件,所有数据以均数士标准差表示,两组间均数比较采用独立样本t检验,多组间均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)最小显著差数(LSD)法,p<0.05(双侧)提示有显著的统计学差异。研究结果 1、体外实验中,高表达ILK基因能促进MSCs的细胞活力(p<0.001)、细胞增殖(p<0.001)、细胞迁移能力(p<0.001),同时减少细胞凋亡(p<0.001);2、USPIO标记MSCs的标记率达到100%,本实验的最佳标记浓度为50ug/ml,最低检测到的细胞数为1×104/0.5ml细胞;MR信号随标记浓度、细胞数及代数减低。3、在体MR内实验显示,MR显示MSCs及ILK-MSCs移植后3天的MR低信号区面积及信号变化幅度均较24h增大(P<0.05),而1周时面积较3天增大(P<0.05),但信号变化幅度较3天减低(P<0.05),2周后面积及信号变化幅度均较1周时减低(P<0.05)。两组比较,ILK-MSCs组移植后24h、3天及1周时MR低信号面积及信号变化幅度均较MSCs组大(P<0.05),而2周时MR低信号面积及信号变化幅度均较MSCs组小(P<0.05)。心肌首过灌注显示ILK-MSCs组移植后随时间相对灌注值较MSCs及PBS组高(P<0.05),MSCs组较PBS组高(P<0.05);延迟增强成像发现ILK-MSCs组细胞移植后梗死面积较移植前减小,MSCs组面积变化不大,而PBS组较移植前面积增大;心功能成像发现ILK-MSCs组局部心功能较另外两组改善明显(P<0.05);ILK转染组GFP及USPIO颗粒较对照组多;ILK转染组的MSCs移植能降低纤维化程度(P<0.001),减少细胞凋亡(p<0.001),增加血管密度(p<0.001),增加细胞增殖(p<0.001)。研究结论 本研究首次在在体证实,ILK-MSCs移植能够提高移植细胞的归巢率,促进梗死心肌周围心肌细胞增生,减少凋亡,促进血管新生,减少胶原增生,最终明显提高猪心肌梗死MSCs移植的疗效。本研究结果为提高缺血性心脏病的细胞治疗疗效提供了新的方法.。