加减温经汤是导师在总结多年临床经验的基础上，由《妇人大全良方》温经汤化裁而来的治疗寒凝血瘀妇科疾病的有效方剂。我们以寒凝血瘀大鼠作为研究对象，施加中药加减温经汤进行干预。观察寒凝血瘀大鼠生殖激素、神经介质和免疫因子的变化，以及加减温经汤对寒凝血瘀大鼠生殖激素、神经介质及免疫因子的影响。旨在从免疫-神经-生殖内分泌系统方面探讨寒凝血瘀妇科疾病的形成机理及加减温经汤的治疗作用机制。 第一部分加减温经汤对寒凝血瘀大鼠生殖内分泌的调节和影响 方法： 选择清洁级健康SD雌性大鼠50只，鼠龄3个月，体重230±20g，适应性饲养1周后，随机将其分为5组：即正常对照组(简称“正常组”)，模型对照组(简称“模型组”)，模型+温经汤低剂量组(简称“低剂量组”)，模型+温经汤高剂量组(简称“高剂量组”)，后2组合称“治疗组”，模型+桃红四物汤组(简称“桃红组”)，每组10只。 造模方法采用冰水冷冻的方法复制寒凝血瘀大鼠模型。治疗低剂量组、高剂量组大鼠于造模的第1天开始，分别按14.66g/kg、29.32g/kg给予加减温经汤灌胃，每日1次，连用2周；桃红组按10.826g/kg/日给予桃红四物汤灌胃，每日1次，连用2周；其它两组给予同体积的蒸馏水灌胃。于2周后选择动情间期称重后断头处死大鼠。于实验的第1天起，每日上午做阴道脱落细胞涂片1次，以5％的碱性美蓝溶液染色，用普通光学显微镜观察，判断各组大鼠的动情周期。断头取血，离心，分离血清，分置，采用放射免疫分析法测定血清雌二醇(E2)、孕酮(P)、睾酮(T)、卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)的含量。迅速剖取卵巢、子宫，剔除周围组织，滤纸稍拭后，称重，计算卵巢、子宫重量指数。左侧卵巢、子宫以4％多聚甲醛固定，室温下梯度酒精脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，制成3μm切片，HE染色，光镜观察卵巢、子宫组织形态学变化。 结果： 1一般情况观察模型组大鼠受冻后开始出现寒战，继而表现蜷缩少动，反应迟钝，爪尾部紫暗，耳色暗红，喜扎堆，呼吸微弱，被毛无光泽，饮水量少，小便色清，大便溏泻等症状。治疗组高、低剂量组出现上述症状后很快减轻，恢复正常，桃红组大鼠上述症状有不同程度的改善。 2阴道细胞涂片各组大鼠阴道涂片均显示动情前期、动情期、动情后期、动情间期规律的周期性变化。动情周期：正常组4.3±0.48d，模型组5.5±0.97d，低剂量组5.1±1.11d，高剂量组4.3±0.48d，桃红组5.2±0.92d。间期：正常组1.3±0.48d，模型组2.4±0.84d，低剂量组1.7±0.67d，高剂量组1.5±0.53d，桃红组2.1±0.57d。其中模型组大鼠动情周期延长，主要表现为间期延长，与正常组比较差异有显著性(P＜0.01)；经加减温经汤治疗，低剂量组大鼠动情间期与模型组比较有所缩短(P＜0.05)，高剂量组大鼠动情周期和动情间期与模型组比较皆有所缩短(均P＜0.01)；桃红组与模型组比较动情周期、动情间期有所缩短但其差异无统计学意义；高剂量组与桃红组比较动情周期、动情间期皆缩短，其差异有统计学意义(均P＜0.05)。高剂量组与低剂量组比较动情周期、动情间期皆缩短其差异有统计学意义(均P＜0.05)。 3大鼠卵巢、子宫重量指数的变化 卵巢重量指数：正常组34.63±4.25mg/g，模型组31.72±4.07mg/g，低剂量组31.37±2.93mg/g，高剂量组32.88±4.85mg/g，对照组31.38±3.16mg/g。各组大鼠卵巢重量指数之间差异无统计学意义。 子宫重量指数：正常组182.22±42.16mg/g，模型组187.01±50.28mg/g，低剂量组182.39±39.45mg/g，高剂量组210.38±21.03mg/g，桃红组209.70±45.03mg/g。各组大鼠子宫重量指数之间差异无统计学意义。 4大鼠卵巢、子宫组织形态学的改变 卵巢组织形态学的改变：正常组大鼠卵巢形态正常，可见各期卵泡及其黄体组织；模型组卵巢可见各级卵泡但数量较少，未见成熟卵泡，血管管径变细；低剂量组、高剂量组可见各级卵泡，血管基本正常；桃红组可见各级卵泡，但成熟卵泡较少。 第二部分加减温经汤对寒凝血瘀大鼠下丘脑神经介质的调节和影响 方法： 实验动物分组、造模方法和给药方法同第一部分。于两周后选择动情间期称重后断头取脑，剥离硬脑膜后用手术刀片沿大脑皮层后缘与小脑前缘交界分离下丘脑组织，称重，1/2下丘脑组织置生理盐水中煮沸5分钟，取出后迅速冷却；研磨制成匀浆，用氢氧化钠中和酸，离心，取上清液，采用放射免疫分析方法测定下丘脑中β-EP含量。另1/2下丘脑组织加入预先冰冷的加入少量酸化正丁醇的玻璃匀浆器中，研磨制成匀浆，采用荧光分光光度法测定下丘脑中NE、DA、5-HT的含量。 结果： 1大鼠下丘脑β-EP含量 正常组74.81±3.68pg/mg，模型组105.13±20.57pg/mg，低剂量组89.51±7.97pg/mg，高剂量组76.52±6.82pg/mg，桃红组90.63±5.90pg/mg。模型组大鼠下丘脑β-EP含量较正常组明显升高，有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，治疗高、低剂量组大鼠下丘脑β-EP含量显著降低(P＜0.01，P＜0.05)，高剂量组的治疗效果明显优于低剂量组(P＜0.01)；桃红组大鼠下丘脑β-EP含量较模型组显著降低(P＜0.05)。治疗高剂量组的治疗效果明显优于桃红组(P＜0.05)。 2大鼠下丘脑5-HT、NE、DA含量 下丘脑5-HT含量：正常组0.61±0.14μg/g，模型组0.99±0.07μg/g，低剂量组0.76±0.08μg/g，高剂量组0.63±0.07μg/g，桃红组90.63±5.90μg/g。模型组大鼠下丘脑5-HT含量较正常组明显升高，有统计学意义(P＜0.01)。与模型组比较，治疗高、低剂量组大鼠下丘脑5-HT含量显著降低(均P＜0.01)，高剂量组的治疗效果明显优于低剂量组(P＜0.05)；桃红组大鼠下丘脑5-HT含量较模型组显著降低(P＜0.01)。治疗高剂量组的治疗效果明显优于桃红组(P＜0.01)。 第三部分加减温经汤对寒凝血瘀大鼠免疫调控的影响 方法： 实验动物分组、造模方法和给药方法同第一部分。断头处死大鼠，取血，离心，取血清分置，置于-20℃冰箱备检。采用放射免疫分析法测定血清IL-1、IL-2、TNF-α的含量。迅速将卵巢组织置于4％多聚甲醛+0.1％DEPC溶液中固定，脱水、石蜡包埋，制作4μm厚切片，采用免疫组织化学SP法检测卵巢组织IL-1、TNF-α蛋白表达。用彩色病理图文分析系统分析IL-1、TNF-α在卵巢组织切片中表达的平均灰度，以代表阳性信号的表达强度。最后进行组间比较。 结果： 1血清IL-1、IL-2、TNF-α放免检测结果 血清IL-1含量：正常组0.20±0.05ng/ml，模型组0.12±0.02ng/ml，低剂量组0.14±0.03ng/ml，高剂量组0.19±0.03ng/ml，桃红组0.15±0.05ng/ml。 血清IL-2含量：正常组4.43±0.74ng/ml，模型组3.12±0.34ng/ml，低剂量组3.42±0.69ng/ml，高剂量组4.04±0.42ng/ml，桃红组3.70±0.57ng/ml。 血清TNF-α含量：正常组0.53±0.09ng/ml，模型组0.70±0.06ng/ml，低剂量组0.66±0.10ng/ml，高剂量组0.55±0.11ng/ml，桃红组0.59±0.04ng/ml。 2卵巢组织IL-1、TNF-α免疫组化测定 卵巢组织IL-1免疫组化测定：正常组121.34±5.14，模型组103.11±4.74，低剂量组108.28±5.34，高剂量组116.04±6.43，桃红组109.03±4.32。IL-1阳性表达定位于细胞浆内，为棕黄色染色。在大鼠卵巢颗粒细胞、黄体细胞、卵泡液中均有表达，在髓质血管周围有少量表达。模型组大鼠卵巢组织IL-1表达增强，与正常组比较其差异有统计学意义(P＜0.01)；经温经汤治疗后，高剂量组卵巢组织IL-1表达减弱，与模型组比较其差异有统计学意义(P＜0.01)；高剂量组卵巢组织IL-1的表达较低剂量组、桃红组减弱，比较其差异均有统计学意义(均P＜0.05)。 结论 1加减温经汤能促进寒凝血瘀大鼠卵巢发育，改善卵巢组织形态结构，调节血清E2、P、T、LH、FSH水平，从而调节生殖内分泌功能。 2加减温经汤能调节寒凝血瘀大鼠下丘脑β-EP、5-HT、NE、DA分泌释放，调节神经内分泌功能。 3加减温经汤能够调节寒凝血瘀大鼠血清IL-1、IL-2、TNF-α活性和卵巢组织IL-1、TNF-α的表达。改善寒凝血瘀时的免疫功能。 总之，寒凝血瘀时大鼠免疫-神经-生殖内分泌系统调节紊乱，加减温经汤能够调节免疫-神经-生殖内分泌网络，使之趋于平衡，治疗寒凝血瘀妇科疾病。