研究目的:AKT在细胞增殖、迁徙以及细胞存亡中发挥重要作用,NF-κB是AKT重要下游靶蛋白。已有研究证实AKT/NF-κB信号通路与癫痫密切相关。MK2206是AKT特异性变构抑制剂,可以抑制AKT的磷酸化,从而抑制AKT激活。MK2206可有效抑制多种恶性肿瘤细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡,表现出良好的抗肿瘤活性。坏死性凋亡(necroptosis,Nec)是近年发现的一种新型细胞死亡方式,受到特别死亡信号通路调控。受体相互作用蛋白(receptor-interacting protein,RIP)1和3是坏死性凋亡信号通路中非常重要的调节蛋白。研究表明,坏死性凋亡出现在多种损伤相关性疾病如心肌缺血、脑缺血等。根据上述研究背景提出本论文的研究目如下:1.运用AKT特异性变构抑制剂MK2206预处理C57BL/6雄鼠,氯化锂-毛果芸香碱(lithium-pilocarpine(Li-Pilo))诱导持续性高频癫痫样放电模型(continues epileptiform high-frequency bursts,SEs),探索 MK2206 在 SEs 小鼠模型对 AKT/NF-κB信号通路的影响。2建立无镁外液诱导的原代培养海马神经元自发性反复癫痫样放电模型(Spontaneous recurrent Epileptiform discharges,SREDs),给予 MK2206预处理,进一步探索MK2206对大鼠SREDs模型AKT/NF-κB的影响。3在MK2206预处理的SREDs模型中,检测坏死性凋亡信号通路相关蛋白mRNA表达水平,探讨癫痫海马神经元坏死机制。研究方法:第一部分AKT变构抑制剂MK2206对SE小鼠模型发作及AKT/NF-κB信号通路的影响(1)研究对象与分组:健康C57BL/6雄鼠随机分为实验pilo90组,对照pilo90组,对照pilo30组。实验pilo90组造模前予MK2206 50mg/kg腹腔注射3次/周,持续两周;腹腔注射Li-Pilo诱发SEs(pilo90mg/kg)。对照pilo90组和对照pilo30组,两组均造模前予1%DMSO0.1ml/kg腹腔注射3次/周,持续两周,腹腔注射Li-Pilo诱发SEs(对照pilo90组及对照pilo30组,pilo剂量分别为90mg/kg和30mg/kg)。小鼠痫性发作Racine评分达IV级及以上并且SE持续60分钟,视为造模成功。(2)对各组小鼠进行行为学比较(评价指标包括致痫率、潜伏期、SE持续时间、单次癫痫发作持续时间,各时间点Racine评分)。(3)利用免疫印迹技术检测各组小鼠海马组织中AKT、p-Thr308-AKT、p-Ser473-AKT、p-IKKαβ、IKKαβ、NF-κB(胞浆)、p-NF-κB(胞浆)、NF-κB(胞核)、p-NF-κB(胞核)蛋白表达动态变化,探索AkT/NF-κB信号通路与癫痫的关系。(4)HE染色及NISSLE染色观察各组小鼠海马组织病理改变。第二部分AKT变构抑制剂MK2206对无镁液诱导原代培养海马神经元痫样放电模型中AKT/NF-κB信号通路及坏死性凋亡的影响(4)研究对象及分组;取24小时内SD乳鼠海马进行原代海马神经元培养。分为正常对照组(培养第7天予生理性基础处理溶液继续孵育24小时);正常对照+MK2206组(培养第7天MK2206lμmol/L继续孵育24小时);SREDs组(培养第7天予Mg2+-free孵育3h建立SREDs大鼠模型);SREDs+MK2206组(培养第7天予MK2206 1μmol/L孵育24小时,继续予Mg2+-free处理3h)。(2)利用免疫印迹技术检测各组细胞中AKT、p-Thr308-AKT、p-Ser473-AKT、p-IKKαβ、IKKαβ、NF-κB、p-NF-κB 蛋白表达水平。(3)实时定量荧光PCR法检测坏死性凋亡相关蛋白基因RIP1mRNA、RIP3mRNA及MLKLmRNA表达水平的差异,在大鼠海马神经元痫样放电模型中探讨癫痫海马神经元坏死机制。研究结果第一部分AKT变构抑制剂MK2206对SE小鼠模型癫痫发作及AKT/NF-κB信号通路的影响1.各组行为学比较:(1)致痫率:实验pilo90mg组较对照pilo90mg致痫率明显减低(P=0.043),有统计学差异;实验pilo90mg组与对照pilo30mg组比较及对照pilo90mg组与对照pilo30mg比较,致痫率均无明显统计学差异。(2)SE潜伏期:实验pilo90mg组、对照pilo90mg组、对照pilo30mg组达到Ⅳ级发作的潜伏期分别为 9.88±2.32min、6.23±1.95min、8.44±0.83min。实验 pilo90mg 组较对照组pilo90mg潜伏期明显延长(P=0.034);实验pilo90mg组与对照组pilo30mg比较,潜伏期无统计学差异。对照pilo90mg组较对照pilo30mg组潜伏期明显缩短(P=0.045),有统计学差异。(3)SE持续时间:实验pilo90mg组、对照pilo90mg组、对照pilo30mg组SE持续时间分别为:35.49±1.79min、46.81±8.76min、28.80±9.73min。实验 pilo90mg 组较对照 pilo90mg组SE持续时间明显缩短(P=0.03),有统计学差异。对照pilo90mg组较对照pilo30mg组SE持续时间明显延长(P<0.01)有明显统计学差异。实验pilo90mg组较对照组pilo30mg组无统计学差异。(4)单次SE持续时间:实验pilo90mg组、对照pilo90mg组、对照pilo30mg组单次SE持续时间分别为:14.50±2.80min、26.22±7.57min、11.67±2.80min。实验 pilo90mg 组与对照组pilo90mg组比较,SE持续时间明显缩短(P=0.028)。对照pilo90mg组与对照pilo30mg组比较,SE持续时间明显延长(P=0.01)。实验pilo90mg组与对照pilo30mg组比较无统计学差异。(5)实验pilo90mg组与对照pilo90mg组各时间点Racine评分比较:实验pilo90mg组SE后各时间点Racine评分较对照pilo90mg组比较,P值分别为:P=0.037(5min);P=0.024(10min);P=0.030(15min);P=0.018(20min);P=0.011(25min);P=0.014(30min);P=0.027(35min);P=0.031(40min);P=0.029(45min);P=0.016(50min);P=0.027(55min);P=0.016(60min),各时间点 P 值比较均有统计学差异。2.免疫印迹技术检测各组SE小鼠模型AKT/NF-κB信号通路重要蛋白表达的改变。(1)MK2206对SE小鼠模型海马组织中AKT、p-Thr308-AKT及p-Ser473-AKT表达的影响:实验pilo90mg组较对照pilo90mg组,p-Thr308-AKT/AKT减低(P=0.019),p-Ser473-AKT/AKT 减低(P=0.023),有统计学差异。以上两组比值,比较实验pilo90mg组与对照组pilo30mg、对照pilo90mg与对照组pilo30mg比较均无统计学差异。(2)MK2206对SE小鼠模型海马组织中p-IKKαβ表达的影响:实验pilo90mg组较对照pilo90mg组p-IKKαβ/IKKαβ减低(P=0.018),有统计学差异。比较实验pilo90mg组与对照组pilo30mg、对照pilo90mg与对照组pilo30mg均无统计学差异。(3)MK2206对SE小鼠模型海马组织中NF-κB(胞浆)、p-NF-κB(胞浆)、NF-κB(胞核)及p-NF-κB(胞核)表达的影响:实验pilo90mg组较对照pilo90mg组 p-NF-κB/NF-κB(胞浆)减低(P=0.038),实验 pilo90mg 组较对照 pilo90mg组p-NF-κB/NF-κB(胞核)减低(P=0.041),有统计学差异。以上两组比值,比较实验pilo90mg组与对照组pilo30mg及对照pilo90mg与对照组pilo30mg比较,均无统计学差异。3.SE小鼠模型海马组织HE染色及NISSLE染色结果(1)HE染色(200倍)对各组SE小鼠模型海马CA1区及CA3区神经元进行观察:对照pilo30组的CA1区及CA3区少部分海马神经元肿胀,核仁显示不清、细胞质深染,部分神经细胞与周围脑间质的空隙增大。对照pilo90mg组可见细胞排列紊乱,神经元肿胀,部分细胞形态不规则、呈梭形或三角形、分布不均、细胞周围间隙增宽,细胞核固缩、核仁显示不清、细胞质深染。实验pilo90mg组海马神经元损害较对照pilo90mg组轻,可见部分神经元肿胀,部分神经元形态不规则,胞核固缩深染、周围空泡形成,少部分细胞排列紊乱。(2)NISSLE染色(200倍)对各组SE小鼠模型海马CA1区及CA3区神经元进行计数:实验pilo90mg组CA1区神经元计数较对照pilo90mg组细胞数明显增多(P=0.023),有统计学差异。对照pilo30组CA1区神经元数量较对照pilo90组明显增多(P=0.012),有统计学差异。实验pilo90mg组CA1区神经元数量较对照pilo30mg组无统计学差异。实验pilo90mg组CA3区神经元细胞计数较对照pilo90mg组细胞数明显增多(P=0.039),有统计学差异。对照pilo30组CA3区神经元数量较对照pilo90组明显增多(P=0.007),有统计学差异。实验pilo90mg组CA3区神经元数量较对照pilo30mg组无统计学差异。第二部分AKT变构抑制剂MK2206对无镁液诱导原代培养海马神经元痫样放电模型AKT/NF-κB信号通路及坏死性凋亡的影响。1利用免疫印迹技术检测各组大鼠海马神经元痫样放电模型AKT/NF-κB信号通路重要蛋白表达的改变。(1)MK2206对各实验组及对照组AKT、p-Thr308-AKT及p-Ser473-AKT表达的影响:SREDs+MK2206 组较 SREDs 组p-Thr308-AKT/AKT 减低(P=0.028),p-Ser473-AKT/AKT 减低(P=0.011),有统计学差异。SREDs+MK2206 组及 SREDs组与正常对照组及正常对照+MK2206组比较,p-Thr308-AKT/AKT及p-Ser473-AKT/AKT明显增多(P<0.01),具有明显统计学差异。(2)MK2206对各实验组及对照组p-IKKαβ蛋白表达的影响:SREDs+MK2206组较SREDs 组 p-IKKαβ/IKKαβ减低(P=0.021)有统计学差异。SREDs+MK2206 组及SREDs组与正常对照组及正常对照+MK2206组比较,p-IKKαβ/IKKαβ明显增多(P<0.01),具有明显统计学差异。(3)MK2206对各实验组及对照组NF-κB及p-NF-κB/NF-κB表达的影响:SREDs+MK2206 组较 SREDs 组 p-NF-κB/NF-κB 减低(P=0.030),有统计学差异。SREDs+MK2206组及SREDs组与正常对照组及正常对照+MK2206组比较,p-NF-κB/NF-κB明显增多(P<0.01),具有明显统计学差异。2实时荧光定量qRT-PCR方法检测坏死性凋亡信号通路相关蛋白mRNA水平改变:(1)MK2206对各实验组及对照组RIP1mRNA的影响:SREDs+MK2206组较SREDs组RIP1mRNA相对表达量减少(P=0.036),有统计学差异。SREDs+MK2206组与SREDs组与两对照组比较,RIP1mRNA相对表达量明显升高,P<0.01有明显统计学差异。(2)MK2206对各实验组及对照组RIP3mRNA的影响:SREDs+MK2206组较SREDs组RIP3mRNA相对表达量减少(P=0.017),有统计学差异。SREDs+MK2206组与SREDs组与两对照组比较,RIP3mRNA相对表达量明显升高,P<0.01有明显统计学差异。(3)MK2206对各实验组及对照组MLKLmRNA的影响:SREDs+MK2206组较SREDs组MLKLmRNA相对表达量减少(P=0.018),有统计学差异。SREDs+MK2206组与SREDs组与两对照组比较,MLKLmRNA相对表达量明显升高,P<0.01有明显统计学差异。实验结论1予MK2206预处理,明显降低SE小鼠模型致痫率,延长潜伏期,缩短癫痫发作持续时间,减低各时间点Racine评分,减轻SE小鼠症状。2SE小鼠模型中AKT/IKK/NF-κB信号通路被早期激活。胞浆及胞核均能检测到p-NF-κB,SE小鼠NF-κB被激活并发生了核移位。3 MK2206抑制SE小鼠AKT/IKK/NF-κB信号通路的激活。MK2206抑制AKT两个重要的磷酸化位点308位苏氨酸残基及473位丝氨酸磷酸化,抑制AKT激活。MK2206 间接抑制AKT的下游IKK复合物及IKK下游NF-κB早期激活。4 MK2206可以减轻SE小鼠海马神经元的损伤,对海马神经元有保护作用。5 SREDs大鼠模型中AKT/IKK/NF-κB信号通路被激活。6 MK2206抑制SREDs大鼠模型AKT/IKK/NF-κB信号通路激活。7坏死性凋亡是SREDs大鼠模型海马神经元死亡机制之一。8 MK2206抑制坏死性凋亡信号通路RIP1/RIP3/MLKL相关蛋白的mRNA,减轻坏死性凋亡程度。