论文部分内容阅读
为了从转录水平揭示人ZNF313基因的调控机制，本文首先克隆了全长为1.1kb的ZNf313基因5上游的启动子片段，然后用PCR方法扩增了ZNf313基因的启动子不同区域的片段，构建了含人ZNF313基因启动子不同片断的荧光素酶报告基因表达体系。以pRL-TK为内参照质粒，瞬时转染HEK293T细胞，48h后收集细胞，测定荧光素酶的相对表达活性。结果发现，在ZNF313基因的启动子区域构建了四种荧光素酶报告基因表达体系pGL3-215(-215 bp～+38 bp)、pGL3-160(-160 bp～+38 bp)、pGL3-133(-133 bp～+128 bp)和pGL3-8(-8 bp～+128 bp)。其中pGL3-215表达载体的荧光素酶相对表达活性最高，pGL3-160和pGL3-133表达载体的荧光素酶相对表达活性几乎相同，且是pGL3-215的75％，而pGL3-8的荧光素酶相对表达活性急剧下降，接近于零。这表明-133 bp～-8 bp区域内含有人ZNF313基因转录所必需的启动子序列。生物信息学的分析表明：两个SPl、一个AP-2和一个T-Ag是人ZNF313基因启动子所必需的。
为了进一步研究人ZNF313基因的表达及其在细胞中的定位，本文构建了ZNF313-荧光融合蛋白基因表达载体，然后经真核表达质粒-脂质体介导，将其导入H293T细胞系。荧光显微镜观察显示：在空白载体pEGFP-N1转染的H293T细胞中，荧光布满了整个细胞，而在转染阳性载体pEGFP-ZNF313的H293T细胞中，荧光主要集中在细胞核中。这表明转染的H293T细胞系能高效表达人ZNF313蛋白，且表达的蛋白定位于细胞核内。