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研究背景近年来,由蓝藻水华引起的中毒事件在全球范围内呈上升趋势。蓝藻水华发生后,水体会检测到大量的蓝藻毒素,其中最常见且危害最严重的是微囊藻毒素（MCs）。据报道已经有超过200多个MCs异构体,微囊藻毒素-LR（MCLR）是其中一种毒性较强的种类。前期已有大量研究发现,MCLR可引起机体内分泌功能损伤,亲本暴露MCLR会导致子代甲状腺功能紊乱,影响子代生长发育,但MCLR如何影响甲状腺激素变化的分子机制尚不清楚。目的本研究通过动物实验探讨MCLR对母体及子代斑马鱼甲状腺功能的影响,通过体外实验研究未折叠蛋白反应（UPR）在MCLR致甲状腺毒性中的作用机制。该研究强调了甲状腺内分泌紊乱对水生生物和人类的潜在影响。方法第一部分体内实验1.将受精卵随机分为三组进行MCLR暴露:对照组、5μg/L MCLR组、25μg/L MCLR组。3个月后,筛选出雌鱼,与正常雄鱼交配产生F1代。2.计算F1代胚胎的3天孵化率、幼鱼的7天存活率;测量7天幼鱼的心率并测量体长、体重,并收集F1代7天幼鱼的行为学数据。3.RT-PCR法检测母体及子代斑马鱼下丘脑-垂体-甲状腺轴（HPT轴）相关基因及甲状腺发育相关基因的变化;Western blot法检测GRP78、TG等蛋白的表达。4.ELISA法检测F0代及F1代斑马鱼相关激素的变化。第二部分体外实验5.活性氧检测试剂盒检测FRTL-5细胞的氧化应激情况。6.Annexin V-FITC/PI双染试剂盒检测细胞的凋亡情况。7.RT-PCR法检测FRTL-5细胞甲状腺相关基因的变化;Western blot法检测GRP78、TG等蛋白的表达。8.细胞免疫荧光法检测细胞GRP78与TG的共定位情况并计算共定位率。9.抑制grp78后通过RT-PCR法、Western blot法、细胞免疫荧光法等方法验证内质网应激是否参与MCLR所致的甲状腺毒性。10.抑制perk、ern1后通过RT-PCR法、Western blot法、细胞免疫荧光法等方法验证PERK、IRE1通路在MCLR所致甲状腺毒性中的作用。结果第一部分雌性斑马鱼暴露于MCLR会影响母体及子代甲状腺激素变化,并影响子代生长发育（1）MCLR暴露影响母体及子代激素浓度:母体暴露于不同浓度的MCLR后,与对照组相比,母体及子代血清T3、T4浓度均明显下降。（2）MCLR暴露影响母体及子代HPT轴相关基因的表达:PCR实验检测母体及子代与甲状腺激素调节、转运、结合和代谢相关的基因,并检测了子代甲状腺发育相关基因,结果发现甲状腺相关基因均发生了改变。（3）MCLR影响子代生长发育:5μg/L MCLR组和25μg/L MCLR组胚胎3dpf孵化率及幼鱼7 dpf体重、体长及心率均出现了不同程度的下降,且呈剂量依赖性,而幼鱼7 dpf存活率仅在25μg/L MCLR组显著下降。行为学检测发现,5μg/L MCLR组与25μg/L MCLR组7 dpf幼鱼在不同光照-黑暗周期下的平均速度均明显下降。第二部分MCLR暴露引起ROS过量产生并诱发内质网应激及细胞凋亡（1）随着MCLR染毒剂量的不断升高,活性氧的水平也随之升高。使用抗氧化剂NAC后,活性氧的水平明显下降;同样的,使用内质网应激抑制剂4PBA后,活性氧的水平也明显下降。（2）MCLR处理可刺激GRP78蛋白的转录和表达,提示MCLR可诱导FRTL-5细胞产生内质网应激。与单独使用10μg/m L MCLR相比,4PBA+10μg/m L MCLR组内质网应激标志物GRP78水平明显降低,同样,用NAC预处理FRTL-5细胞可以减轻内质网应激。（3）MCLR处理以浓度依赖的方式诱导细胞凋亡。进一步检测抗氧化剂NAC和内质网应激抑制剂4PBA对细胞凋亡的影响,4PBA及NAC预处理可显著抑制MCLR诱导的细胞凋亡。第三部分未折叠蛋白反应（UPR）在MCLR致甲状腺毒性中的作用（1）Western blotting来测定TG的表达水平,10μg/m L MCLR组TG的表达水平显著高于对照组。通过免疫荧光双染将GRP78与TG共定位发现,与对照组相比,暴露于10μg/m L MCLR组共定位的细胞明显增多。进一步检测抗氧化剂和内质网应激抑制剂对TG的影响,NAC+10μg/m L MCLR组及4PBA+10μg/m L MCLR组共定位的细胞相比10μg/m L MCLR组显著减少。（2）抑制perk,ern1后Western blotting测定TG的表达水平。与10μg/m L MCLR组相比,perk-si RNA+10μg/m L MCLR组TG的表达水平显著下降,同样ern1-si RNA+10μg/m L MCLR组TG的表达水平也显著下降。免疫荧光共定位结果显示,抑制perk或抑制ern1后,共定位的细胞相比10μg/m L MCLR组均明显降低。结果证明内质网应激下游PERK通路及IRE1通路均参与了这一过程。（3）抑制perk,ern1后PCR测定相关基因的表达水平。与10μg/m L MCLR组相比,抑制perk或抑制ern1均能明显逆转HPT轴相关基因的表达。但对于甲状腺发育相关基因而言,抑制perk后,nkx2.1,pax8,hhex等基因的表达均未得到恢复,而抑制ern1后,nkx2.1,hhex基因得到了一定程度的恢复,这一发现表明仅IRE1通路参与了甲状腺发育的过程。结论雌性斑马鱼暴露于MCLR会影响母体及子代甲状腺激素变化,为了探究MCLR引起的具体分子作用机制,结合动物实验和细胞实验结果发现:MCLR暴露引起ROS过量产生,并诱发内质网应激及细胞凋亡。内质网应激通过IRE1及PERK通路造成甲状腺球蛋白阻留于内质网,从而影响甲状腺激素的合成。MCLR还可以通过IRE1通路破坏甲状腺发育的过程。综上所述,MCLR通过内质网应激通路来阻滞甲状腺球蛋白,从而导致激素分泌的减少和甲状腺发育的破坏,进而影响子代发育。