基于pcDNA 3.1(+)/VEGF121转染干预体外原代培养心肌细胞的机制探讨以及7T MRI多技术联合量化重组质粒转染SD大鼠心梗模型的实验研究

来源 :中国人民解放军医学院 | 被引量 : 0次 | 上传用户:liuyan881119
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冠状动脉闭塞引起相应供血的心肌严重缺血坏死称之心肌梗死(Myocardial infarction,MI),其主要机制体现在心肌细胞凋亡,成纤维细胞增殖以及血管内皮细胞损伤等异常改变,其中心肌细胞凋亡在MI过程中发挥重要作用;当对应供血的心肌缺血区域称为危险区(Area at risk,AAR),心梗后心肌如未及时恢复血供,可导致心肌由心内膜下向心外膜下发展,最终导致心肌细胞大量丧失,形成不可逆的心肌梗死区,称之为心梗核心区(myocardial infarction core,MIC),最终发生心力衰竭。因此,寻找心肌梗死的关键机制以及如何安全、准确地早期评估及有效治疗缺血性心肌病,仍是目前迫切需要解决的难题。近年来基因治疗缺血性心肌病逐渐成为热点。VEGF是一种具有内皮细胞特性的有丝分裂原,既往研究主要集中在在其"治疗性血管新生"的作用,治疗方式主要蛋白治疗及基因治疗;而心肌细胞凋亡在MI进程中发挥重要作用,其内在影响机制仍有待阐述。选择合适的治疗手段及干预途径很重要,心脏作为重要特殊脏器,如何检测病理生理变化及干预疗效亦重要。心脏MR已经成为评价心脏结构及功能的无创检查的"金标准",其MR多技术联合成像,Cine-MRI可提供心脏功能检测,T2-mapping以及Late Gadoinium Enhancement(LGE)技术联合应用基本可较准确地反应坏死心肌面积危险区AAR及梗死核心区,可提供心脏形态、功能、活性、及血流动力学等全方位信息。本研究基于pcDNA 3.1(+)/VEGF121转染干预体外原代培养心肌细胞的机制探讨以及7T MRI多技术联合量化重组质粒转染SD大鼠心梗模型的实验研究,分为三个部分:第一部分pcDNA 3.1(+)/VEGF121转染体外培养的原代心肌细胞的表达及作用机制研究目的:pcDNA3.1(+)/VEGF121转染体外培养的原代心肌细胞活性验证,以及干预缺氧心肌细胞凋亡模型的内在机制探讨。方法:MTT法确定pcDNA3.1(+)/VEGF121时效及量效关系,以Wester-blot明确其转染心肌细胞后VEGF蛋白表达。实验分为6组,以工具药CdC12(钙离子通道抑制剂)、NPS2390(CaSR受体抑制剂)以及Calpeptin(钙蛋白酶抑制剂)干预。以MTT法和LDH检测心肌细胞损伤,TUNEL、ANNEXINV-FITC/PI染色计数和caspase-3活性检测分析心肌细胞凋亡,Western-blot分析CaSR、calpain、AIF及tBid蛋白表达。MTT法验证其对成纤维细胞的增殖影响。结果:转染组心肌细胞VEGF表达增高,较模型组显著降低caspase-3活性,可不同程度减低CaSR、calpain、AIF及tBid的蛋白表达。NPS2390(CaSR受体抑制剂)以及Calpeptin(钙蛋白酶抑制剂)干预组caspase-3活性降低,下调calpain和tBid、AIF的蛋白表达量,CdCl2(钙离子通道抑制剂)结果无明显抑制作用。MTT法成纤维细胞的研究结果细胞增殖降低。结论:pcDNA3.1(+)/VEGF121转染细胞成功,可逆转缺氧心肌细胞凋亡,对成纤维细胞有抑制增殖的作用。其干预心肌细胞凋亡机制可能是通过降低CaSR激活,降低calpain活性,减少其从线粒体释放到细胞浆,即通过CaSR抑制内途径线粒体内钙依赖性蛋白酶通路,而不依赖Ca2+通道,为整体动物模型的干预奠定理论基础。第二部分Sprague-Dawley大鼠心梗模型制备及7TMR多技术联合评价心梗模型中心肌缺血及活性的运用研究目的:建立SD大鼠心梗模型以及运用7T MR多技术联合评价心肌缺血及判断心肌活性的实验研究。方法:20只雄性SD大鼠随机分为2组:心梗模型组(开胸结扎SD大鼠左前降支),假手术组(仅开胸不结扎)。联合运用心脏电影Cine-MR、T2-mapping以及延迟增强扫描(LGE)等多技术分析心肌信号强度变化,定量评估心梗危险区(area at risk,AAR),梗死核心区(myocardiaum infarction core,MIC)以及可挽救心肌(salvageable myocardial zone,SMZ),结束CMR观察后取心脏组织观察心脏大体解剖,与病理组织学检查(包括TTC、HE染色)结果进行对照。结果:Cine-MRI测量心脏平均舒张期末期容枳,假手术组与模型组有显著统计学差异,成功建模。T2-mapping、LGE序列定量检测AAR以及MIC,对比组织学有良好的相关性,同时T2-mapping还可定量心梗区T2值定量定性心肌出血。心梗后AAR与MIC之差的SMZ结果显示与组织学对比具有良好相关性。结论:7T MR多技术联合成像可准确界定心肌梗死不同区域,图像质量好,评价准确可靠,SMZ可作为反映心肌活性的重要指标,为动物水平pcDNA 3.1(+)/VEGF121转染模型的疗效评价及机制探讨奠定良好的基础。第三部分基于7T MRI多技术联合评价pcDNA3.1(+)/VEGF121质粒转染SD大鼠心梗模型的实验研究目的:建立pcDNA3.1(+)/VEGF121转染SD大鼠心梗模型以及7TMR多技术联合评价pcDNA 3.1(+)/VEGF121质粒转染心梗模型的实验研究。方法:24只雄性SD大鼠随机分为2组:VEGF干预组(通过改良冠状动脉灌注法),心梗模型对照组。运用心脏电影Cine-MR、T2-mapping以及延迟增强扫描(LGE)序列于24h,48h,72h,7天不同时间点分析其信号强度变化,观察定量心梗危险区(area at risk,AAR),梗死核心区(myocardiaum infarction core)以及可挽救心肌(salvageable myocardial zone,SMZ)的对比模型组的演变过程。结束CMR对比取材心脏大体解剖,并与病理检查(包括TTC、HE、Masson染色以及免疫组化)结果进行对照。结果:Cine-MRI显示pcDNA3.1(+)/VEGF121重组质粒转染组对比心梗模型组,舒张末期容积增高,心梗核心区MIC以及可挽救心肌SMZ明显减低,同时MIC、SMZ以及心梗危险区AAR均呈现递减趋势;第7天组间AAR以及T2值组间无统计学差异。Westem-blot结果显示,质粒转染组VEGF蛋白表达升高,CaSR及caspase-3蛋白表达降低。结论:pcDNA3.1(+)/VEGF121通过冠状动脉灌注转染有效。7T CMR序列可无创定量评价质粒转染疗效,但水肿后期采用T2值以及AAR评价心梗需要慎重。同时转染组发挥心肌保护作用的途径可能与抑制心肌细胞凋亡,血管内皮细胞增殖、抑制胶原增生等机制密切相关。
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