基于配体垂钓筛选蓝点马鲛鱼肉蛋白中的黄嘌呤氧化酶抑制肽

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黄嘌呤氧化酶(XOD)是人体内最后一个将嘌呤代谢为尿酸的酶,通过抑制黄嘌呤氧化酶的活性来降低血尿酸,减少其在人体内的沉积,是治疗痛风的方式之一。本文旨在构建磁性纳米粒子,固定黄嘌呤氧化酶,基于“配体垂钓”从复杂的蓝点马鲛鱼肉蛋白酶解物中获得具有黄嘌呤氧化酶抑制效果的生物活性肽。采用高效液相色谱法检测嘌呤含量,探究活性肽的XOD抑制效果。从活性肽的抑制类型和抗氧化能力初步阐述活性肽的抑制机理。论文研究结果如下:1.通过高效液相色谱法检测水产品中四种嘌呤,并对线性关系、精密度、重复性、加标回收能力进行探究。结果表明,该方法能够在11 min前将4种嘌呤完全分离。之后测定了常见海洋贝类各部位的嘌呤含量,其中所测贝类嘌呤含量以虾夷扇贝最高,最高部位为腺体,高达148.09mg/100g。螺类中嘌呤含量以香螺(卡民氏峨螺)最高,最高部位为腺体,高达155.88 mg/100g,建议高尿酸患者避免食用。2.采用溶胶凝胶法制备磁性纳米粒子,并以此为内核,通过二氧化硅表面修饰,3-氨基丙基三乙氧基硅烷表面官能团化,以及戊二醛活化程序,将黄嘌呤氧化酶固定在磁性颗粒表面。采用红外光谱、XRD、TEM对磁性纳米颗粒进行表征测定,观察到二氧化硅表层能够均匀分布于磁珠表面,并将黄嘌呤氧化酶固定于磁性纳米颗粒表面,且活化后的磁珠表面黄嘌呤氧化酶固定量达到116.12μg/mg。3.使用磁性纳米颗粒,通过配体垂钓程序从蓝点马鲛鱼肉蛋白酶解液中获得黄嘌呤氧化酶抑制肽,并用HPLC-MS/MS鉴定,得到四个氨基酸序列。合成两个序列IIAPPER和AGFAGDDAPR,进行抑制效果考察,得到半抑制浓度IC50分别为6.08 mg/mL和6.15 mg/mL。4.对IIAPPER(IR-7)进行后续研究,评价其抗氧化能力,并初步研究其抑制机理。荧光光谱结果显示,该活性肽可以淬灭黄嘌呤氧化酶荧光强度,其DPPH清除能力相当于0.033 mM/mL的维生素C,总抗氧化能力相当于0.76 mM当量的水溶性维生素E;ADME预测其血脑屏障透过率极低。分子对接结果表明该活性肽能够进入黄嘌呤氧化酶活性抑制的关键位点,从而抑制黄嘌呤和次黄嘌呤向尿酸转化。尽管理论上IIAP的氨基酸组成具有更高的抗氧化能力,但是通过IIAP和PPER对黄嘌呤氧化酶抑制实验表明,IIAP抑制效果不及PPER。
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