背景子痫前期(preeclampsia)主要发生在妊娠20周以后,以新出现的高血压和蛋白尿为主要特征。部分患者没有蛋白尿,但出现了其他器官损害:比如急性肾功能损害、肝功能损害、神经系统并发症、血液系统并发症、子宫胎盘功能障碍等。子痫前期是妊娠期一个严重的并发症,发病率约3%-8%。为世界范围内引起孕产妇及围产儿死亡的主要原因,每年导致大约70000孕产妇死亡,以及超过5万围产儿死亡。在发展中国家,由于对孕期妇女缺乏健康状况的评估及监测,不能在疾病早期进行干预,子痫前期成了导致孕产妇和围产儿死亡的主要原因之一。子痫前期发病率高,而且病情往往在没有任何征兆的情况下迅速恶化,对母亲和胎儿造成严重的影响。对孕妇可引起心衰、肝肾功能损害甚至衰竭、呼吸窘迫、中枢神经系统损害、弥散性血管内凝血(disseminated intravascular coagulation,DIC)、抽搐、昏迷,严重者发生HELLP综合征(溶血、转氨酶升高、血小板减少)、甚至引起孕妇死亡。对胎儿可导致胎儿生长受限、胎盘早剥、早产以及早产相关并发症如新生儿呼吸窘迫、脑瘫、脑出血、坏死性小肠炎、甚至围产儿死亡。子痫前期孕妇发生死胎、死产、新生儿死亡的风险显著上升。近年来子痫前期的孕妇早产的比例较过去显著升高,分娩孕周的总体趋势不断减小。除了近期影响,子痫前期也会对母亲和后代造成远期的影响。有子痫前期病史的妇女远期发生高血压、心血管疾病、中风、糖尿病的风险增加,而且子痫前期作为一个独立的因素增加了母亲因心血管疾病死亡的风险。同时子痫前期对子代的心血管、免疫、神经学上的健康产生不利的影响,对子代高血压的影响尤为显著,而且子痫前期还会降低子代的认知功能。子痫前期仍是产科医生面临的巨大挑战,目前尚无有效的治疗方法或者预防措施,分娩仍是重度子痫前期的唯一治疗方法。其发病机制仍不是很明确。但是明确的是子痫前期的发生与胎盘有关,因为胎盘娩出后子痫前期的症状会消失。子痫前期被认为是两阶段发展过程:胎盘形成异常,然后是母体免疫功能失调。在第一阶段:胎儿细胞滋养细胞侵袭不足,导致螺旋动脉重塑不足,最终减少了胎盘灌注。第二阶段全身的炎症反应。胎盘低灌注引起缺血诱导包括促炎性细胞因子在内的生物活性因子的释放,最终介导了子痫前期特征性的广泛的内皮细胞损伤,引起子痫前期的典型症状:高血压和蛋白尿。胎盘释放的多种细胞因子成为了子痫前期病因学中胎盘浅着床、炎症免疫过度激活、以及血管内皮损伤之间的交叉点。妊娠本身被认为是一种适度的炎症反应,但炎症反应过度在子痫前期的病理生理过程中起着重要作用。在过去几十年里,人们对炎性因子进行了广泛研究,促炎性细胞因子的增加会在整个孕期导致子宫胎盘灌注和血管损伤,进而使子痫前期症状恶化。这提示炎症因子在子痫前期的发生、发展的过程中起着重要的作用,在某种程度上可以反应疾病的严重程度。促炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha,TNF-α)和白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6)是母体免疫系统的重要介质,在子痫前期时其水平会发生变化,在疾病的发生发展中起了重要作用。研究发现TNF-α、IL-6在严重子痫前期中水平明显升高,可以介导子痫前期的一些临床表现,并提示抗炎靶向药物可能在子痫前期的控制中起作用。TNF-α在免疫调控以及炎症反应中扮演着重要角色。TNF-α其对血管内皮具有毒性作用,能够促进内皮细胞黏附因子的表达。同时,TNF-α还能产生抗体依赖的细胞毒效应,造成内皮细胞损伤,提高血管的通透性,促使体液和蛋白从血管中渗出以及激活机体的凝血系统等。除此之外,TNF-α还具有引起血管活性物质合成和释放亢进的作用,从而引起全身小动脉广泛性痉挛,最终使机体血压上升。TNF-α水平的变化与病理妊娠相关。母体内TNF-α含量过多与早产、胎盘内出血坏死以及胎儿发育迟缓之间存在密切联系,同时TNF-α表达水平上调还与子痫前期的发生和发展相关。子痫前期发生时TNF-α表达量增高,胎盘滋养细胞的凋亡率也随之上升。IL-6为机体中重要的免疫调节因子,可由各种细胞如内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞等。研究表明,IL-6与子痫前期的发生之间存在密切联系。正常妊娠的维持是建立在胎儿和母体之间免疫平衡基础上的,而一旦这一平衡被打破则会导致母体对胎儿的排斥反应,引起病理妊娠,如子痫前期等。研究显示,子痫前期孕妇血清中IL-6含量较对照组发生显著上调,胎盘生成IL-6的能力明显增加。在妊娠早期的胎盘组织中能够检测到大量的IL-6表达,且蜕膜中也存在IL-6表达,这一结果提示IL-6可能与其他因子协同,进而共同影响了母儿的相融合以及滋养细胞的浸润过程。除此之外,IL-6还在胎盘血管的形成过程中扮演着重要角色。所以胎盘IL-6表达上调能够引起滋养细胞侵入表浅以及胎盘血管床形成障碍,最终导致胎盘滋养细胞缺血缺氧事件的发生,上述一系列过程可能构成了子宫胎盘缺血的免疫基础,最终导致了子痫前期的发生。由于研究人类子痫前期的分子机制面临各种伦理问题,而且可能影响母婴健康,动物模型被广泛的应用于子痫前期的研究。在子痫前期由于低氧压力导致胎盘暴露于波动的氧气浓度下。胎盘的低氧压力直接或间接导致了母体循环中的氧化应激。这种压力会导致胎盘释放多种促炎性因子。有学者利用低氧应激诱导妊娠大鼠模拟与子痫前期相关的生理环境,大鼠出现血压升高、蛋白尿、胎儿生长受限等临床表现,成功建立子痫前期的大鼠模型。目的在本研究中,我们假设低氧压力能够导致大鼠胎盘中促炎性因子TNF-α、IL-6的表达改变并引起子痫前期的类似症状。并猜测胎盘中促炎性因子TNF-α、IL-6的表达与子痫前期的临床症状存在联系。我们通过低氧诱导建立子痫前期大鼠模型,并检测胎盘中炎症细胞因子TNF-α、IL-6的表达变化,并进一步探讨其改变与血压、尿蛋白、肝肾功能损害、胎儿体重的关系。旨在寻找有效预测子痫前期的生物标志物,及早发现子痫前期的的发生并监测病情变化,防止严重并发症的发生,改善孕产妇及围产儿的预后,也有望为子痫前期的治疗提供一个突破口。方法SD大鼠适应性喂养一周之后,将雌鼠与雄鼠按照4:5比例合笼过夜,每天上午9点采集雌鼠阴道生理盐水冲洗液并镜检,当发现精子者记录为第0天。常规喂养到妊娠第15天,将60只妊娠大鼠随机分为对照组、子痫前期组和治疗组,每组20只。其中对照组给予常压氧,子痫前期组大鼠给予10%低氧,而治疗组在10%低氧诱导同时连续1周经尾静脉注射抗高血压药物曲前列尼尔,剂量60ng/kg。在妊娠第15、18和21天时分别用大鼠尾动脉无创血压监测仪检测3组妊娠大鼠的尾动脉血压,同时采用BCA试剂盒检测各组大鼠尿液中的尿蛋白水平。在妊妊娠第21天时,用水合氯醛麻醉大鼠,采集血清检测肝功能(ALT、AST)和肾功能(BUN、Cr)。然后处死大鼠采集胎盘、肝脏、肾脏组织,并检量胎鼠体重。HE染色观察大鼠肝脏、肾脏组织形态变化,免疫组织化学检测IL-6、TNF-α在胎盘中的定位表达。分别采用荧光定量PCR、Western Blot法检测胎盘组织中IL-6和TNF-α mRNA和蛋白的表达。采用Pearson相关性检验对促炎性细胞因子IL-6、TNF-α与血压、尿蛋白、肝肾功能、胎儿体重的相关性进行分析。结果(1)三组大鼠平均血压和尿蛋白的比较:与对照组相比,子痫前期组的血压及尿蛋白在不同时间段显著上升(P<0.05);治疗组与对照组相比血压及尿蛋白在不同时间段的差异无统计学意义(P>0.05)。(2)三组大鼠肝功(ALT、AST)和肾功(BUN、Cr)的比较:与对照组相比,子痫前期组的ALT、AST、BUN、Cr水平升高,差异具有统计学意义(P<0.05);然而治疗组与对照组相比ALT、AST、BUN、Cr的差异无统计学意义(P>0.05)。见。(3)三组胎鼠体重的比较:与对照组相比,子痫前期组的胎鼠体重明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05);而治疗组与对照组相比胎鼠的体重差异无统计学意义(P>0.05)。(4)三组大鼠肝脏和肾脏组织病理学变化:子痫前期组大鼠肾脏出现肾小球硬化,广泛的内皮细胞肿胀,毛细血管腔有较大的狭窄、闭塞。肝脏肝细胞索紊乱,肝细胞变性,发现纤维蛋白血栓并且伴有局灶性坏死。而对照组和治疗组肝脏和肾脏的组织结构形态未发生明显改变。(5)IL-6和TNF-αmRNA在胎盘组织的表达:子痫前期组大鼠胎盘组织中IL-6和TNF-αmRNA表达水平均明显高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),而治疗组与对照组相比胎盘组织中IL-6和TNF-αmRNA的表达差异均无统计学意义(P>0.05)。(6)IL-6和TNF-α蛋白Western Blot检测结果:子痫前期组大鼠胎盘组织中IL-6和TNF-α蛋白表达水平明显高于对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),而治疗组与对照组相比胎盘组织中IL-6和TNF-α蛋白的表达差异均无统计学意义(P>0.05)。(7)IL-6和TNF-α蛋白免疫组化检测结果:三组大鼠胎盘组织均有IL-6、TNF-α蛋白的表达,IL-6主要表达定位于胎盘滋养细胞的细胞核中,绒毛毛细血管的内皮细胞也可以见到少量表达,呈黄色或棕黄色颗粒状染色。TNF-α蛋白阳性表达主要定位于胎盘滋养细胞的细胞核和细胞质中,呈黄色或棕黄色颗粒状染色。(8)胎盘中TNF-α蛋白表达水平与血压、尿蛋白、肝肾功能(ALT、AST、BUN、Cr)、胎鼠的相关性分析:胎盘中TNF-α蛋白表达水平与血压、尿蛋白、ALT、AST、BUN、Cr呈正相关,与胎鼠体重呈负相关。(9)胎盘中IL-6蛋白表达水平与血压、尿蛋白、肝肾功能(ALT、AST、BUN、Cr)、胎鼠的相关性分析:胎盘中IL-6蛋白表达水平与血压、尿蛋白、ALT、AST、BUN、Cr呈正相关,与胎鼠体重呈负相关。结论(1)10%低氧诱导妊娠大鼠出现血压升高、尿蛋白、肝肾功能损害、胎儿生长受限的表现,成功建立子大鼠痫前期的模型;(2)IL-6和TNF-α在子痫前期大鼠胎盘组织中的表达水平均发生显著上调;(3)IL-6和TNF-α蛋白表达水平与血压、尿蛋白、肝功指标(ALT、AST)、肾功(BUN、Cr)呈正相关;与胎鼠体重呈负相关;(4)IL-6和TNF-α参与了子痫前期的发生,且其表达浓度的高低与疾病的严重程度密切相关。