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交联酶聚集体(CLEA)是一类新型的无载体酶固定化技术,因具有无需载体、制备简单、酶活回收率高、成本低廉、操作和保存稳定性强等众多优点,已经成为酶固定化领域的研究热点。氨基酰化酶I(EC 3.5.1.14)是工业上最重要的L-氨基酸生产酶之一,能够拆分N-乙酰-L-氨基酸生产相应的L-氨基酸。将CLEA技术用于氨基酰化酶的固定化预期会显著提高酶活回收率,降低用酶成本。但目前,仍未见有氨基酰化酶交联聚集体制备方面的报道。本文研究和优化了氨基酰化酶交联聚集体的制备方法,并将其用在中空纤维膜酶反应器中连续拆分N-乙酰-DL-蛋氨酸生产L-蛋氨酸。主要包括以下内容:(1)在聚乙二醇6000、叔丁醇和乙二醇二甲醚中,叔丁醇对酶的沉淀性能最好,当其浓度为80%(V/V)时可将酶完全沉淀,几乎100%的酶活力得到保留。通过在沉淀前加入牛血清白蛋白(BSA),形成酶和BSA的共聚集体,解决了氨基酰化酶很难被有效交联形成稳定的交联聚集体的问题。经过优化,当BSA添加量为10 mg/100 mg酶、戊二醛(GA)与酶的质量比为0.75:1时,酶活回收率可达82%。(2)优化了三种环氧基交联剂对氨基酰化酶的交联效果。当以聚乙二醇二缩水甘油醚(PGDE)为交联剂时,得到的氨基酰化酶交联聚集体的酶活回收率最高,可达92%。环氧基交联剂与氨基酰化酶交联的机理和戊二醛是不同的,环氧基交联剂交联氨基酰化酶时,不仅与ε-胺基发生反应,还和巯基发生反应。(3)与自由酶相比,氨基酰化酶交联聚集体的pH稳定性、储藏稳定性和热稳定性明显增强。自由酶的热失活符合一级指数模型,而氨基酰化酶交联聚集体的热失活则满足二阶指数模型。提出了氨基酰化酶交联聚集体的热失活机理,建立了热失活动力学方程。从热失活动力学和热力学角度解释了交联酶聚集体高耐热性的原因。(4)研究了氨基酰化酶交联聚集体拆分N-乙酰-DL-蛋氨酸的催化特性。37℃下,自由酶、GA-E-BSA和PGDE-E的米氏常数Km分别为0.964 mmol/L、1.50 mmol/L和1.02 mmol/L;分子转化数分别为0.687 mmol/g·min、0.803 mmol/g·min和1.023 mmol/g·min;底物抑制常数Kir分别为699 mmol/L、725 mmol/L和671 mmol/L;产物(L-蛋氨酸和乙酸)竞争性抑制常数Kip分别为3.429 mmol/L、3.091 mmol/L和3.448 mmol/L。(5)采用中空纤维膜酶反应器以氨基酰化酶交联聚集体连续拆分N-乙酰-DL-蛋氨酸来制备L-蛋氨酸。研究了底物浓度和停留时间对转化率的影响。对反应体系进行数学模拟,得到的模型能较好的描述体系稳态后的反应行为。