非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）是目前世界范围内发病率和死亡率增长最快、预后最差的恶性肿瘤之一。虽然近年来化疗、放疗和手术方法不断发展,但肺癌患者总的5年生存率仍没有得到明显的改善,始终徘徊在4%～14%,主要原因在于局部复发和远处转移。国内外的基础及临床研究表明:NSCLC是一种发病早期就可出现转移的恶性肿瘤,超过半数以上的肺癌患者确诊时已属相对晚期,预后较差。虽然近十年来化疗药物发展颇快,但疗效仍处于平台盘旋状态,因此如何提高NSCLC治疗有效率迫在眉睫。近年来的研究发现环氧化酶2（cyclooxygenase-2,COX-2）在NSCLC细胞中有高的表达,并且与肺癌的发生、发展及预后密切相关。COX-2可通过多种途径参与肺癌的作用,如抑制细胞生长增殖、改变细胞周期分布、抑制新生血管形成、抑制侵袭转移、促进凋亡、免疫调节作用等机制有关。因此,选择性阻断或抑制COX-2的活性,可能有利于NSCLC的预防和治疗。氯美昔布（lumiracoxib,LUM）是一种新型第二代COX-2选择性抑制剂,目前发现它可有效治疗关节炎、轻到重度急性疼痛（如牙痛及痛经等）。但其是否具有抗人肺癌细胞增殖活性及诱导癌细胞凋亡的作用国内外尚未见报道。此外,到目前为止化疗药物包括多西他赛（docetaxol,DOC）在内治疗NSCLC仍然毒性较大,因此探讨选择性非甾体抗炎药联合化疗的抗NSCLC作用及其作用机制有重要的理论及临床意义。本研究探讨了LUM的体外抑制NSCLC细胞增殖作用及与DOC联合使用时的增效作用,并初步研究了其作用机制,尤其是探讨LUM调节Bcl-2介导的凋亡是否通过MAPK（ERK）信号转导通路,以进一步阐明COX-2表达与NSCLC发生发展的关系,为COX-2抑制剂可能预防和治疗肺癌提供理论依据。1.LUM对A549和NCI-H460增殖的影响采用MTT法检测LUM体外抑制A549和NCI-H460细胞增殖的量效和时效关系。结果显示:（1）加入不同浓度(15、30、60、120、240μmol·L^-1)的LUM,48h后测定细胞增殖抑制率。发现LUM在上述浓度范围内对A549和NCI-H460细胞的增殖均有抑制作用,药物浓度越高,抑制作用越强,呈明显的剂量依赖效应关系。以浓度的对数与抑制率进行直线相关分析:A549:r=0.957,P＜0.01。其IC₅₀值:2597.17μmol·L^-1。NCI-H460:r=0.912,P＜0.01。其IC₅₀值:832.72μmol·L^-1。LUM对两种细胞株的抑制作用不同。（2）系列浓度LUM作用于A549和NCI-H460细胞24h、48h、72h及96h后观察细胞的生长情况,结果显示LUM作用时间越长,抑制作用也越强,呈时间依赖性。2.LUM与DOC联合应用对A549和NCI-H460细胞增殖的影响将15、30、60、120、240μmol·L^-1五种浓度的LUM与DOC 0.2、2μmol·L^-1联用,显示LUM与DOC联合使用对A549和NCI-H460细胞的抑制作用明显增强。采用两药相互作用指数（CDI）分析,结果表明在合适的剂量下LUM与DOC对A549和NCI-H460细胞的增殖有明显协同抑制作用（CDI＜1）。3 LUM抑制NSCLC作用的机制探讨3.1 LUM对A549和NCI-H460细胞凋亡的形态学影响采用吖啶橙（Acridine orange,AO）荧光染色,观察细胞的形态学改变。在荧光显微镜下可见未处理的A549和NCI-H460肿瘤细胞增殖旺盛,细胞核中有大量DNA,表现为黄绿色荧光深浅不一的结构样特征;LUM作用A549和NCI-H460细胞24h后,细胞密度减少,并可见典型的凋亡细胞形态特征:核固缩、体积缩小和表面起泡,凋亡细胞核染色质呈黄绿色浓聚在核膜内侧,可见凋亡小体。LUM与DOC联合应用组诱导凋亡作用较单独用药组明显增强。3.2 LUM诱导A549和NCI-H460细胞凋亡的流式细胞仪分析应用流式细胞仪（Flow Cytometry,FCM）检测A549和NCI-H460细胞凋亡率。LUM单独应用可诱导A549和NCI-H460细胞发生凋亡,其诱导凋亡作用呈现明显的浓度、时间依赖关系。LUM与DOC联合应用24h后凋亡率明显高于单独用药组,提示两药合用对诱导A549和NCI-H460细胞凋亡有协同作用。3.3 LUM对A549和NCI-H460细胞周期的影响应用Mcycle软件分析LUM作用后细胞周期的变化。结果发现,LUM可引起A549和NCI-H460细胞S期细胞减少,G₀/G₁期细胞增多,提示LUM使细胞生长阻滞于G₀/G₁期,而G₂/M期变化轻微,这将有利于DOC更好地发挥抗肿瘤作用。3.4 LUM对A549和NCI-H460细胞PGE₂及cAMP的影响采用放射免疫法（RIA）检测PGE₂及cAMP水平。不同浓度(15、30、60、120、240μmol·L^-1)的LUM作用于A549和NCI-H460细胞后,发现PGE₂的水平下降、cAMP的水平升高均呈剂量依赖性（P＜0.01）。说明LUM对A549和NCI-H460细胞的增殖抑制作用可能是通过抑制COX-2的活性导致PGE₂的合成减少和cAMP的水平升高来实现的。3.5 LUM对A549和NCI-H460细胞COX-2蛋白表达的影响Western blot法分析不同浓度的(0、15、30、60、120μmol·L^-1)LUM作用于A549和NCI-H460细胞。结果发现在A549细胞中,随着LUM浓度的增加,COX-2的表达水平逐渐下降。而NCI-H460细胞中不同剂量组间COX-2的表达水平并无明显的变化。提示LUM的抗肿瘤作用机制可能涉及到COX-2依赖性（与抑制COX-2有关）和COX-2非依赖性（与抑制COX-2无关）2种途径。3.6 LUM调节A549和NCI-H460细胞中Bcl-2的信号通路A549和NCI-H460细胞先加入终浓度IL-1β1ng/ml刺激24h,再加入不同浓度(0、15、30、60μmol·L^-1)LUM继续培养24h,中止反应后刮取细胞,采用Western blot法检测ERK2、p-ERK及Bcl-2表达水平。结果A549和NCI-H460细胞中ERK2及p-ERK水平均下降,并伴有Bel-2水平的下降（P＜0.01）。这一结果表明LUM可通过MAPK（ERK）信号转导通路调节肺癌细胞产生Bcl-2。3.7 LUM对A549和NCI-H460细胞中凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax表达的影响用0、15、60、240μmol·L^-1的LUM处理A549和NCI-H460细胞48 h。用Westernblot法检测Bcl-2、Bax表达水平。结果发现随着LUM浓度的增大,Bcl-2蛋白表达逐渐下降,而Bax蛋白表达在A549细胞中增强,在NCI-H460细胞中不变,Bcl-2/Bax的比值下降。4结论本研究表明,LUM对A549和NCI-H460细胞的增殖有抑制作用,且呈明显的剂量和时间效应关系;LUM与DOC联合应用具有明显的协同作用。LUM抑制A549和NCI-H460细胞增殖作用的机制可能与诱导细胞凋亡、改变细胞周期、降低PGE₂水平、上调cAMP的水平有关,且可能涉及到COX-2依赖性和COX-2非依赖性两条途径。LUM可通过MAPK（ERK）信号转导通路调节肺癌细胞产生Bcl-2,进而诱导Bcl-2/Bax的比值下降而引起肿瘤细胞凋亡。