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目的:研究N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(N-acetyl glucosamine transferase,OGT)对组蛋白去乙酰化酶1(histone deacet ylases 1,HDAC1)的O-连接的N-乙酰葡萄糖胺(O-linked N-acetyl glucosamine,O-GlcNAc)修饰的调节作用,并探讨其在肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)的发生发展作用及其分子机制。方法:1.通过免疫共沉淀和麦胚外源凝聚素方法证明HDAC1是否存在O-GlcNAc修饰;通过OGA的抑制剂PUGNAC处理肝癌细胞,检测HDAC1的O-GlcNAc修饰情况;通过免疫共沉淀和Western Blot,在组织水平和细胞水平上检测OGT、HDAC1及其糖基化表达情况;运用质谱分析HDAC1的O-GlcNAc糖基化位点,并将其糖基化位点突变后检测HDAC1的O-GlcNAc水平。2.通过免疫共沉淀检测OGT与HDAC1的内源性相互作用;通过GST-pull down、免疫共沉淀证明OGT与HDAC1外源性相互作用;通过免疫荧光共聚焦研究OGT与HDAC1的共定位情况;通过过表达外源性OGT,分析OGT对HDAC1的O-GlcNAc调节情况。3.通过HDAC荧光活性分析试剂盒、Western Blot和免疫共沉淀检测HDAC1的O-GlcNAc修饰对HDAC1酶活性的影响以及HDAC1糖基化和磷酸化之间的关系。4.通过流式细胞术分析HADC1的O-GlcNAc修饰对肝癌细胞周期的影响;运用CCK-8实验检测OGT、HDAC1及其O-GlcNAc修饰对肝癌细胞增殖的影响,并通过免疫印迹检测细胞周期蛋白分子的表达情况;运用免疫印迹和RT-PCR检测HDAC1的O-GlcNAc突变对p21蛋白和mRNA水平表达的影响;通过荧光素酶报告基因和染色体免疫共沉淀检测HDAC1的O-GlcNAc修饰对p21启动子活性及Sp1转录活性的影响。通过划痕实验和细胞Transwell侵袭实验分析HDAC1的O-GlcNAc修饰对肝癌细胞迁移及侵袭的影响,并运用Western Blot和RT-PCR检测HDAC1糖基化对E-cadherin蛋白和mRNA表达水平的影响。结果:1.OGT催化HDAC1的O-GlcNAc修饰,并且质谱分析和免疫共沉淀确定主要的糖基化位点为Thr114和Ser263;HDAC1的O-GlcNAc修饰在肝癌组织和细胞上表达增加。2.在肝癌细胞中,OGT与HDAC1存在相互作用,并且免疫共聚焦显示两者共定位于细胞核;过表达OGT可促进HDAC1的O-GlcNAc修饰。3.HDAC1的O-GlcNAc修饰可促进其组蛋白去乙酰化酶活性,并且糖基化的增加可促进HDAC1的磷酸化修饰。4.HDAC1的O-GlcNAc突变可促进p21的表达并且抑制肝癌细胞的生长,这种机制是通过影响Sp1转录活性完成;同样,HDAC1的O-GlcNAc突变可抑制肝癌细胞的迁移及侵袭,同时E-cadherin的表达增加。结论:1.OGT可催化HDAC1的Thr114和Ser263发生O-GlcNAc修饰,并且HDAC1的O-GlcNAc修饰在肝癌中高表达。2.在肝癌中,OGT与HDAC1结合,并促进HDAC1的O-GlcNAc修饰。3.HDAC1的O-GlcNAc修饰可通过促进其磷酸化修饰增强其组蛋白去乙酰化酶活性。4.HDAC1的O-GlcNAc修饰可通过抑制p21的表达促进肝癌细胞的增殖;HDAC1的O-GlcNAc糖基化修饰通过调节E-Cadherin表达促进肝癌细胞的迁移及侵袭。上述结果表明HDAC1的O-GlcNAc修饰可促进肝癌的发生发展。