研究背景:免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia,ITP）是一种临床常见的自身免疫性出血疾病。除了血小板计数减少,ITP患者可有不同程度的出血症状,健康相关生活质量也普遍降低。ITP的病因学包括遗传易感性、环境因素以及免疫耐受失衡,其中免疫细胞对血小板的过度清除及骨髓巨核细胞产生血小板不足是造成患者血小板计数减低的主要原因。根据国内外相关指南推荐,TPO受体激动剂被列为ITP二线治疗的首选药物。艾曲泊帕和罗米司亭均是通过与TPO受体结合后,激活细胞内JAK/STAT、PI3K/AKT、ERK等信号通路,促进巨核细胞产板。多项临床研究及荟萃分析表明,仍有约50%的ITP患者应用TPO受体激动剂后无效或复发,且增加剂量也无法逆转,这是ITP临床管理面临的巨大难题。双醋瑞因是一种非甾体抗炎药,已用于治疗骨关节炎20余年。双醋瑞因在进入体循环前会完全转变为活性代谢产物大黄酸,通过抑制IL-1等多种炎性细胞因子以及NLRP3炎性小体发挥作用。此外,双醋瑞因在联合治疗中展现出增敏作用。塞来昔布联合双醋瑞因通过调控JNK和MAPK信号通路,更有效地缓解了模型鼠的关节炎症。本团队率先观察到2位艾曲泊帕治疗有效的ITP患者因骨关节炎发作加用双醋瑞因治疗后,血小板计数较前显著升高。在一项前瞻性、小样本临床研究的中期分析中,我们发现15例艾曲泊帕治疗无效或复发的ITP患者在艾曲泊帕基础上加用双醋瑞因治疗后,有7例（46.6%）患者获得缓解。这提示双醋瑞因对艾曲泊帕很可能存在增敏作用,二者联用有望提升ITP患者的血小板计数、逆转艾曲泊帕无效或疗效丢失的临床困境。我们猜想,双醋瑞因的活性代谢产物大黄酸对TPO受体激动剂的增敏作用很可能是通过促进巨核细胞产板来实现的。研究目的:1.通过体外细胞培养以及构建ITP主动小鼠模型,探究双醋瑞因的活性代谢产物大黄酸联合TPO受体激动剂对巨核细胞产板的作用。2.利用转录组学和蛋白组学测序,筛选艾曲泊帕联合大黄酸对巨核细胞基因及蛋白的调控靶点。3.通过体内、体外实验,验证PI3K等关键分子对大黄酸联合TPO受体激动剂促进巨核细胞产板的影响,揭示潜在增敏机制,为二者联用优化ITP二线治疗方案提供理论依据。研究方法:1.病例和健康对照:本研究于山东大学齐鲁医院招募符合入排标准的ITP患者以及健康志愿者。在充分知情同意的前提下,收集入组人员的相关病例资料及外周血样本。2.制备血清、分离脐血单个核细胞、诱导巨核细胞:分离患者和对照的血清,冻存于负80℃冰箱;分离脐血单个核细胞,分选CD34+细胞,用含rh-TPO、rh-IL-3、rh-SCF和血清的SFEM培养基诱导巨核细胞,第4天时加入大黄酸（0-100μM）或艾曲泊帕联合大黄酸（0-100μM）培养,第14天收集细胞悬液。3.构建ITP主动小鼠模型:用野生型小鼠血小板免疫CD61基因敲除鼠,将免疫成功的CD61基因敲除鼠的脾细胞传输给辐照后的SCID小鼠,构建ITP主动模型。4.转录组测序:提取艾曲泊帕或艾曲泊帕联合大黄酸处理的ITP患者血清诱导的巨核细胞的RNA,用Illumina平台测序。5.蛋白组学测序:提取艾曲泊帕或艾曲泊帕联合大黄酸处理的ITP患者血清诱导的巨核细胞的蛋白质,用Q Exactive HF-X进行质谱分析。6.流式细胞术:检测体外培养/小鼠骨髓/小鼠脾脏细胞中CD41+、CD41+CD42+巨核细胞比例,检测细胞凋亡、巨核细胞多倍体、巨核细胞PI3K和MAPK磷酸化水平。7.细胞因子检测:用LEGEND plex Panel 1试剂盒检测细胞培养上清中9种细胞因子水平,用ELISA试剂盒检测TGF-β1水平。8.PI3K抑制实验:在体外细胞实验和ITP主动模型中使用PI3K抑制剂,检测抑制PI3K信号对艾曲泊帕联合大黄酸促进巨核细胞产板的影响。研究结果:1.艾曲泊帕联合大黄酸（10μM）显著增加培养体系中巨核细胞和血小板数量。大黄酸单药（1-100μM）对体系中巨核细胞和血小板的生成均无促进作用。艾曲泊帕联合10 μM大黄酸较艾曲泊帕单药显著促进巨核细胞和血小板的生成,但艾曲泊帕联合其他浓度大黄酸（1μM、50 μM、100μM）则无此作用。2.艾曲泊帕联合大黄酸显著促进培养体系中CD41+巨核细胞多倍体成熟、凋亡和血小板产生。在体外培养体系中加入适量艾曲泊帕治疗无效或复发的ITP患者血清,模拟ITP患者巨核细胞异常状态。艾曲泊帕联合大黄酸组较艾曲泊帕单药组显著增加体系中CD41+、CD41+CD42+、CD41+CD61+巨核细胞比例,显著促进CD41+巨核细胞多倍体成熟、巨核凋亡、血小板生成。3.罗米司亭联合大黄酸显著提升ITP主动模型小鼠的血小板计数和巨核细胞比例,促进CD41+巨核细胞多倍体成熟。由于艾曲泊帕不能激活小鼠的TPO受体,我们选择罗米司亭完成体内试验。在ITP主动模型中,大黄酸单药组（10 mg/kg、30 mg/kg）血小板较对照组无明显改善。罗米司亭联合大黄酸（10 mg/kg）组较罗米司亭单药组的血小板计数在第21天和第28天均显著升高,而罗米司亭联合高浓度大黄酸30 mg/kg则无此作用。罗米司亭联合大黄酸（10 mg/kg）组小鼠骨髓和脾脏中CD41+CD42+巨核细胞比例均较罗米司亭单药组显著升高。并且,罗米司亭联合大黄酸（10 mg/kg）组小鼠骨髓中CD41+巨核细胞多倍体比例也显著高于罗米司亭单药组。4.转录组测序解析艾曲泊帕联合大黄酸对基因表达的调控。对7对艾曲泊帕联合大黄酸或者艾曲泊帕单药处理后的ITP患者血清体外诱导的巨核细胞开展转录组学测序,筛选到515个差异基因。GO和KEGG分析显示,差异基因主要与巨核细胞分化、血小板形成、整合素受体、细胞骨架、TGF-β、PI3K、MAPK等信号通路相关。5.蛋白组学测序解析艾曲泊帕联合大黄酸对蛋白表达的调控。对4对艾曲泊帕联合大黄酸或者艾曲泊帕单药处理后的ITP患者血清诱导的巨核细胞开展TMT标记蛋白质组学分析,筛选到62个差异蛋白。GO和KEGG分析提示,差异蛋白与TGF-β、IL-17等细胞因子、整合素受体、细胞骨架、PI3K信号通路紧密相关。6.艾曲泊帕联合大黄酸对培养体系中细胞因子的调控作用。艾曲泊帕大黄酸联合治疗组的TGF-β1水平较艾曲泊帕单药组显著上调。联合治疗组IFN-α、IFN-γ、IL-12p70、IL-17A、IL-18、IL-23、IL-33 水平较单药组显著下调。两组间TNF-α和IL-1β的水平无明显差异。7.艾曲泊帕联合大黄酸通过活化PI3K磷酸化信号促进巨核细胞产板。在体外实验中,艾曲泊帕大黄酸联合治疗组CD41+巨核细胞的PI3K磷酸化水平较艾曲泊帕单药组显著升高,但两组间巨核细胞MAPK磷酸化水平无明显差异。艾曲泊帕+PI3K抑制剂组与艾曲泊帕联合大黄酸+PI3K抑制剂组在巨核细胞比例、多倍体比例、血小板数量方面均无显著差异。8.罗米司亭联合大黄酸通过调节PI3K磷酸化提升主动模型小鼠血小板计数。在主动模型中,罗米司亭联合大黄酸组小鼠骨髓CD41+巨核细胞的PI3K磷酸化水平较罗米司亭单药组显著升高,但两组间MAPK磷酸化水平无差异。罗米司亭+PI3K抑制剂组与罗米司亭联合大黄酸+PI3K抑制剂组小鼠的第21天和第28天血小板计数均无明显差异。研究结论:1.艾曲泊帕联合大黄酸较艾曲泊帕单药显著增加培养体系中巨核细胞比例、多倍体成熟、巨核凋亡,促进血小板生成。2.罗米司亭联合大黄酸较罗米司亭单药显著改善ITP主动模型小鼠血小板减少,增加骨髓中巨核细胞比例和多倍体成熟。3.在TPO受体激动剂基础上加用大黄酸,可以进一步活化巨核细胞PI3K磷酸化信号,调节多种细胞因子分泌,促进巨核细胞成熟和产板,发挥增敏作用。研究背景:免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia,ITP）是一种临床常见的出血性疾病,目前尚缺乏可用于明确临床诊断或提示预后的生物标志物。自身抗体致敏的血小板被携带Fcγ受体的单核/巨噬细胞吞噬是ITP的关键发病机制之一。ITP患者的活化型Fcγ受体存在异常高表达,促炎型M1细胞也存在过度极化,二者密切相关且均会增强单核/巨噬细胞的吞噬功能、加剧血小板破坏。以ITP患者Fcγ受体表达失衡和M1细胞极化异常为切入点,调节单核/巨噬细胞的吞噬功能及免疫状态,是阻断ITP患者血小板破坏的有效途径。CD44跨膜糖蛋白分子在单核/巨噬等免疫细胞表面广泛表达,其功能具有多样性。CD44分子不仅在巨噬细胞对凋亡细胞或病原微生物的吞噬过程中发挥关键作用,它还参与多种炎症反应过程,如免疫细胞粘附、迁移、活化和增殖等。CD44分子还可以通过诱导促炎型M1细胞募集和激活,加剧脂肪炎症、肝脏炎症、骨关节炎以及下游炎性细胞因子分泌。此外,血浆中游离CD44水平异常升高与自身免疫性疾病的病情活动密切相关。这些研究强调了 CD44分子在巨噬细胞吞噬过程和炎症反应中的重要作用,也提示CD44分子有望成为自身免疫疾病治疗的一个关键靶点。但是,关于ITP患者的CD44水平是否存在异常、CD44分子与ITP病情活动的相关性如何,国内外尚无相关研究。近年来,以CD44分子为靶点的单克隆抗体（monoclonal antibody,mAb）治疗在多种自身免疫性疾病模型中展现出强大的免疫调节能力和抗炎作用,如类风湿性关节炎、炎症性肠病、自身免疫性糖尿病等。在ITP小鼠模型中,Crow团队发现CD44单抗（5035-41.1D和KM114）可以有效缓解ITP小鼠血小板减少,并且提示CD44单抗主要是通过靶向单核/巨噬细胞来发挥作用。这些发现挖掘了以CD44为靶点的单抗治疗在ITP中的潜在应用价值,但仍需筛选特异性的抗人CD44单克隆抗体、针对ITP患者来源的单核/巨噬细胞进行体外机制研究,深入探索CD44单抗能否成为ITP治疗的候选策略。研究目的:1.检测ITP患者和健康人的CD44水平,包括血浆中的游离形式和循环中单核/巨噬细胞表面的固态形式,探索CD44水平对ITP疾病严重程度的潜在预测价值。2.以CD44为靶点,选取抗人CD44单克隆抗体BJ18,验证BJ18对ITP患者以及健康人的单核/巨噬细胞吞噬血小板功能的抑制作用。3.探讨BJ18对Fcγ受体表达以及巨噬细胞炎性极化的调节作用,揭示BJ18抑制血小板吞噬的免疫调节机制,为以CD44为靶点的单克隆抗体治疗ITP提供宝贵依据。研究方法:1.病例和健康对照:本研究于山东大学齐鲁医院招募符合入排标准的ITP患者以及健康成年志愿者。在充分知情同意的前提下,收集入组人员的相关病例资料及外周血样本。2.制备血浆、分离外周血单个核细胞、培养单核/巨噬细胞:分离ITP患者及健康对照的血浆并冻存于负80℃冰箱;分离外周血单个核细胞,贴壁培养2小时,弃掉上层培养基,贴壁细胞视作单核/巨噬细胞。3.巨噬细胞的极化:向贴壁的单核/巨噬细胞中加入rh-MCSF培养7天后,贴壁细胞为M0巨噬细胞。加入LPS和rh-IFN-γ诱导2天,使M0向M1方向极化;加入rh-IL-4诱导2天,使M0向M2方向极化。加入BJ18或者IgG同型对照,检测BJ18对M1或M2极化的调控作用。4.血小板的分离、标记和调理:分离健康对照外周血中的血小板,加入前列腺素E1和CMFDA标记1小时,PBS溶液洗涤后,加入抗人CD41单抗调理半小时,洗涤、离心、重悬、计数。5.体外吞噬实验:ITP患者或者健康对照来源的单核/巨噬细胞用不同浓度的BJ18或同型对照过夜预处理,用PMA刺激后再与CMFDA标记CD41单抗调理好的血小板按1:10比例共培养1小时,流式上机检测。6.实时定量PCR:检测BJ18对ITP患者或对照来源的单核/巨噬细胞中FcγRⅡa和FcγRⅡb基因的调控作用,以及BJ18对M1细胞TNF-α和IL-6基因的调控作用。7.流式细胞术:检测ITP患者及对照循环中CD14+细胞表面CD44表达水平,检测BJ18对患者及对照来源的单核/巨噬细胞表面Feγ受体（FcγRⅠ、FcγRⅡa、FcγRⅢ）表达的调控作用,检测BJ18对患者及对照来源的M1（CD68+CD86+）或M2（CD68+CD163+）极化的调控作用。8.酶联免疫吸附法:用人的CD44 ELISA试剂盒检测ITP患者及健康对照血浆游离CD44水平。研究结果:1.ITP患者血浆游离CD44浓度显著高于对照血小板计数低于30×109/L的ITP患者血浆可溶性CD44水平较健康对照组以及血小板计数大于等于30×109/L的ITP患者显著增高。ITP患者血浆中游离CD44水平与血小板计数呈负相关,与出血评分呈正相关。2.ITP患者循环中单核/巨噬细胞表面CD44表达显著高于对照血小板计数低于30×109/L的ITP患者单核/巨噬细胞上CD44水平较健康对照组以及血小板计数大于等于30×109/L的ITP患者显著增高。ITP患者单核/巨噬细胞上的CD44表达与血小板计数负相关,与出血评分正相关。3.抗人CD44单克隆抗体BJ18抑制单核/巨噬细胞吞噬血小板功能BJ18对ITP患者来源的单核/巨噬细胞吞噬血小板有显著抑制作用,且呈现剂量依赖性。BJ18对ITP患者来源的单核/巨噬细胞与血小板的结合无明显调控作用。4.BJ18调控FcγRⅡa而非FcγRⅡb的基因表达BJ18显著降低ITP患者来源的单核/巨噬细胞FcγRⅡa mRNA表达,但对FcγRⅡb mRNA表达无明显影响。5.BJ18 下调 FcγRⅠ、FcγRⅡa 和 FcγRⅢ 蛋白表达BJ18显著降低ITP患者来源的单核/巨噬细胞上活化型受体FcγRⅠ、FcγRⅡa和FcγRⅢ蛋白表达。BJ18显著降低健康对照来源的单核/巨噬细胞上FcγRⅡa和FcγRⅢ蛋白表达,但对FcγRⅠ蛋白表达无明显影响。6.BJ18调控促炎型M1极化,而非抑炎型M2极化BJ18显著降低了 ITP患者和健康人来源的CD68+CD86+的M1细胞百分比,降低其TNF-α和IL-6 mRNA表达;但BJ18对CD68+CD163+的M2细胞则无明显调控作用。研究结论:1.ITP患者血浆游离CD44分子和单核/巨噬细胞表面固态CD44分子水平均较健康人显著升高。CD44水平与ITP患者的血小板计数以及出血评分线性相关。2.以CD44为靶点,抗人CD44单克隆抗体BJ18有效抑制ITP患者来源的单核/巨噬细胞对血小板的吞噬作用。3.BJ18显著下调活化型Fcγ受体（FcγRⅠ、FcγRⅡa和FcγRⅢ）表达以及促炎型巨噬细胞M1极化,从而发挥免疫调节和抗炎作用。4.CD44水平对ITP疾病严重程度具有潜在的预测价值,抗人CD44单克隆抗体BJ18有望成为ITP治疗的新选择。研究背景:免疫性血小板减少症（immune thrombocytopenia,ITP）是一种自身免疫性疾病,其特征是患者血小板计数减少,出血风险增加。经典的ITP发病机制主要涉及致病性抗血小板抗体和细胞毒性T淋巴细胞介导的血小板破坏,以及巨核细胞生成血小板功能障碍等。近30年来,糖皮质激素一直是成人新诊断ITP患者的标准一线治疗方案。泼尼松和地塞米松是ITP治疗中最常应用的糖皮质激素类药物。多项研究表明,成人ITP患者在应用糖皮质激素治疗后的初始反应率从50%到85%不等,但仅有少部分患者能够获得持续缓解。尽管一些ITP患者可以通过延长糖皮质激素治疗时间来维持血小板计数,但从长远来看,糖皮质激素的毒副作用远大于其益处。与单一药物治疗相比,针对不同病理机制的多靶点联合疗法可能更有助于ITP患者获得持续缓解且不增加不良反应。最近,去唾液酸化被认为是一种非Fc受体介导的血小板清除的新机制。在ITP中,抗GPIb-Ⅸ抗体或者细胞毒性T细胞均可诱导神经氨酸酶-1转位,进而使血小板发生去唾液酸化,去唾液酸化的血小板被肝脏Ashwell-Morell受体以非Fc受体依赖的途径吞噬清除。同时,自身抗体介导的去唾液酸化还会导致ITP中巨核细胞分化、血小板生成以及血小板粘附功能受损。在体内实验中,唾液酸酶抑制剂成功地改善了 ITP模型小鼠血小板减少情况。这些鼓舞人心的新发现表明,唾液酸酶抑制剂通过抑制去唾液酸化有望成为ITP治疗的新选择。奥司他韦是一种唾液酸酶特异性抑制剂,在全球范围内广泛用于流感病毒的预防和治疗。两项独立的回顾性研究表明,奥司他韦显著增加患者血小板计数,且与患者是否罹患流感无关。一项随机对照研究表明,在常规治疗基础上加用奥司他韦可显著增加脓毒症患者血小板计数、缩短血小板恢复时间并减少血小板输注次数。之后,数个病例报告报道了奥司他韦有效提升原发性ITP患者和HIV相关ITP患者的血小板计数。此外,在一项针对难治性ITP患者的小样本试点研究中,奥司他韦联合ITP经典药物较奥司他韦单药有效提升患者血小板计数。这些研究初步探索了奥司他韦在ITP治疗中的潜在价值,但仍需要随机对照研究来提供更高级别的循证医学证据。本研究是迄今为止第一个大规模、前瞻性、多中心的随机对照临床试验,旨在评估地塞米松联合奥司他韦对比地塞米松单药在成人新诊断初治ITP患者中的有效性和安全性。研究目的:基于随机对照临床试验的研究方法,比较地塞米松联合奥司他韦与地塞米松单药作为成人新诊断ITP一线初始治疗方案的早期疗效,包括初始有效率和起效时间;比较两种治疗方案的长期疗效,包括随访6个月持续缓解率和总体持续缓解时间;比较患者对这两种治疗方案的耐受性和不良反应,评估其安全性;比较两种治疗方案对患者出血风险和生活质量的改善情况;评估血小板特异性自身抗体对治疗方案的预后价值,为优化ITP一线治疗提供更高等级的循证医学证据。研究方法:1.研究设计及受试者入组:这项前瞻性、多中心、开放性的随机对照试验从国内5家三级甲等医院招募新诊断未接受正规治疗的ITP患者。所有符合入组标准的ITP患者按照1:1 比例随机分配接受地塞米松联合奥司他韦治疗（联合治疗组）或地塞米松单药治疗（单药组）。2.治疗方案:两组患者均口服地塞米松40 mg qd,持续4天（第1-4天）。如果患者血小板计数在第10天仍低于30×109/L或有出血症状,则重复一个疗程地塞米松治疗（40 mg qd,第11-14天）。联合治疗组患者需同时口服奥司他韦75 mg bid,持续10天（第1-10天）。对于联合治疗组中获得初始缓解后又复发的患者,可以根据研究人员建议和患者个人意愿,选择再加用一个疗程奥司他韦治疗（75 mg bid,持续10天）。3.疗效评价:主要研究终点是第14天初始有效率和6个月持续缓解率。次要研究重点包括起效时间、总体有效时间、出血评分、患者生活质量评分、不良反应等。4.统计分析:使用IBM SPSS统计软件23.0版进行分析。通过Fisher精确检验比较两组在初始反应、持续反应、出血时间、不良事件方面的差异。应用Mann-Whitney检验比较两组患者的出血评分、起效时间、血小板计数和ITP-PAQ子量表的变化分数。应用Kaplan-Meier法和log-rank检验比较两组间的反应持续时间。双侧P值小于0.05被认为具有统计学意义。研究结果:1.基线特征2016年2月1日到2019年5月1日期间,共有120名患者接受资格筛查,96名患者接受随机分组（联合治疗组47人,单药组49人）,最终90名患者被纳入改良意向性分析（联合治疗组43人,单药组47人）。两组间基线特征基本平衡。2.早期疗效在改良意向性分析中,地塞米松联合奥司他韦组较地塞米松单药组在第14天的初始有效率显著增高（37/43[86%]vs 31/47[66%];OR 3.18,95 CI%1.13-9.23,P=0.030）,联合治疗组的初始CR率也显著高于地塞米松单药组（27/43[63%]vs 18/47[38%];OR 2.72,95 CI%1.19-6.12,P=0.034）。两种治疗方案均起效迅速,两组间的TTR无显著差异。3.长期疗效在改良意向性分析中,联合治疗组的6个月持续缓解率显著高于地塞米松单药组（23/43[54%]vs 14/47[30%];OR 2.17,95 CI%1.16-6.13,P=0.032）。两组间 12 个月持续缓解率无显著差异。根据Kaplan-Meier分析,两组在18个月随访期内的总体反应持续时间无显著差异（HR 1.42,95%CI 0.86-2.35,log rank P=0.176）。联合治疗组中有8名复发患者接受了第二个疗程奥司他韦治疗,并有5名（63%）患者再次获得缓解,DOR平均延长4个月。4.出血风险在第14天,两组间出血评分和出血事件发生率无显著差异。6个月时,联合治疗组较单药组出血评分显著降低,出血事件发生率显著降低。12个月时,两组间出血评分和出血事件发生率无显著差异。5.血小板特异性自身抗体在地塞米松单药组中,无论抗GPⅡb/Ⅲa抗体状态如何,抗GPIb/Ⅸ抗体阳性患者的初始有效率显著低于抗GPIb/Ⅸ抗体阴性的患者。而对于抗GPIb/Ⅸ抗体阳性（包括单阳性和双阳性）的患者,两种治疗方案间初始有效率无显著差异。6.ITP生活质量评分与地塞米松单药相比,联合治疗方案明显改善了患者的ITP相关症状、总体生活质量这两个子量表评分。7.不良反应整体上两种治疗方案均耐受良好,两组间不良反应发生率无显著差异。大多数不良事件为轻至中度（1至2级）,治疗完成后可自行缓解。研究结论:1.大剂量地塞米松联合奥司他韦治疗成人新诊断ITP的初始有效率、持续缓解率均显著高于地塞米松单药。多周期应用奥司他韦可能更有助于维持患者的血小板反应。2.大部分患者对研究药物耐受良好。3.大剂量地塞米松联合奥司他韦有望成为成人新诊断ITP全口服一线治疗的优化方案。