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研究背景与目的：癫痫(epilepsy)是一种常见的神经系统疾病,在儿童期发病率明显高于其他年龄阶段,发病率约为3.5‰-6.6‰,其发病形式多样,病因复杂,对病人的危害巨大。其中难治性癫痫以内侧颞叶癫痫(mesial temporal lobe epilepsy, MTLE)较为常见,海马硬化为其突出的临床病理特征。迄今为止,MTLE的治疗一直是癫痫治疗的难点,MTLE的发病机制仍是近几十年来癫痫研究的热点与难点。近几年来,关于突触囊泡循环相关调控蛋白的研究已成为一个新的热点。突触囊泡循环是维持神经递质传递的基础,突触囊泡通过胞吐和胞吞作用完成一次突触囊泡循环。大量研究证实,癫痫患者神经元突触有明显的功能异常,这种病态突触通过突触囊泡的快速循环再生使正常情况下每秒仅能传播数次或数十次神经冲动的突触传递功能增加到每秒数十次到数百次,使痫性放电得以迅速扩布。深入研究囊泡的再循环细节以及生理调控的方式和位点,为临床寻找有效治疗靶点,具有重要的理论和实际意义。Dynamin-1,又称发动蛋白-1,是一个96kD的大分子量三磷酸鸟苷酶(GTPase),为GTPase家族成员,近20年的研究从基因、细胞信号调控、蛋白功能等多方面已证实,dynamin-1在网格蛋白介导的突触囊泡胞吞及囊泡循环利用中发挥至关重要的作用。非dynamin-1依赖的其他调控机制能够维持生理状态下基本正常的突触囊泡胞吞功能,而dynamin-1在维持神经元高频、长时程放电过程中发挥了关键作用。因此,以dynamin-1作为靶点进行干预,可以阻断囊泡在高频、长时程电兴奋事件中的快速循环而发挥作用,而对生理状态下的突触传递活动影响甚少。由此可见,dynamin-1有希望成为一个非常有前景、完全不同于传统抗癫痫药物作用机制的抗癫痫新药研发靶点。本实验通过建立幼年大鼠MTLE模型,从一个整体、连续发展的角度探讨dynamin-1在MTLE发生发展过程中的表达变化,同时在人MTLE患儿海马组织中进行验证。并进一步建立离体原代海马神经元癫痫细胞模型,探讨dynamin-1在癫痫发生过程中的机制。从而为难治性MTLE寻找新的药物靶点提供了一个全新的视角。随后,本实验通过构建dynamin-14个结构域的融合蛋白,在大鼠脑神经突触小体中筛选出63个可能与dynamin-1存在相互作用的蛋白,并选取了3个以前从未报道过与dynamin-1有相互作用的蛋白：Rab GDⅠ、C1C-3以TUC-4b,利用免疫共沉淀对其进行自然条件下与dynamin-1相互作用的研究。本研究分为三部分：研究方法：1.利用本实验室已建立的方法,用氯化锂-匹罗卡品诱导3周龄Sprague-Dawley (SD)幼鼠出现癫痫发作,根据MTLE发生发展过程取三个时间点(急性期、潜伏期、慢性期)一共分为6个组：急性期对照组、急性期模型组、潜伏期对照组、潜伏期模型组、慢性期自发发作组、慢性期对照组。运用western blot及免疫组化技术动态观察MTLE大鼠海马组织中dynamin-1及磷酸化dynamin-1蛋白的表达变化。并收集人难治性MTLE术后海马标本,western blot及免疫组化方法检测其表达变化。2.利用新生SD大鼠培养海马神经元,应用无镁细胞外液灌流方法诱导痫性放电,建立癫痫细胞模型。应用dynamin-1抑制剂dynasore抑制dynamin-1的活性,western blot及免疫荧光技术观察癫痫细胞模型中dynamin-1及磷酸化dynamin-1蛋白的表达变化,并利用转铁蛋白进一步研究抑制dynamin-1蛋白活性后癫痫细胞模型胞吞量的改变。3.构建dynamin-14个功能结构域的融合蛋白,与大鼠脑突触小体相互作用,利用GST-pull down联合质谱技术筛选出dynamin-1在大鼠脑神经突触小体中的相互作用蛋白。验证2个已有报道中确切与dynamin-1存在相互作用的蛋白,endophilins以及amphiphysins。并选取3个以前从未报道过的dynamin-1相互作用的蛋白,Rab GDⅠ、C1C-3以及TUC-4b,应用免疫共沉淀对其进行自然条件下与dynamin-1相互作用的研究。研究结果：1. Western blot及免疫组化结果显示磷酸化dynamin-1蛋白在MTLE大鼠急性期及慢性期以及MTLE患儿海马组织中表达较同时期对照组显著降低(P<0.05),在MTLE大鼠潜伏期的表达与同时期对照组相比无差异。而dynamin-1总蛋白在MTLE大鼠各期、MTLE患儿及对照组海马之间表达无明显差异。2. Western blot及免疫组化结果显示磷酸化dynamin-1蛋白在癫痫细胞模型组中表达较对照组显著降低(P<0.05),经dynamin-1抑制剂dynasore预处理的癫痫细胞模型组中磷酸化dynamin-1蛋白表达则与正常对照组基本一致,同时,dynasore对正常对照组磷酸化dynamin-1蛋白表达无明显影响。Dynamin-1总蛋白在海马神经元痫性放电模型及对照组中表达无明显差异。激光显微共聚焦显示癫痫细胞模型组海马神经元胞吞量较正常对照组明显增多(P<0.05)。应用dynasore抑制dynamin-1蛋白活性表达后,痫性放电组海马神经元胞吞量显著减少。同时,dynasore对正常对照组海马神经元胞吞量无明显影响。3.本实验共筛选出63个可能与dynamin-1存在相互作用的蛋白,其中PRD域鉴定出36个蛋白,PH域14个蛋白,GED域7个蛋白,GTPase域6个蛋白。已知的dynamin-1相互作用蛋白endophilins和amphiphysins被证实与dynamin-1存在相互作用关系。未报道蛋白RabGDI以及C1C-3与dynamin-1存在相互作用关系,然而,TUC-4b与dynamin-1之间未检测出相互作用。研究结论：1.磷酸化dynamin-1蛋白在MTLE大鼠急性期、慢性期以及MTLE患儿海马组织中表达较同时期对照组显著降低,提示dynamin-1可能通过磷酸化／去磷酸化过程在癫痫发生发展过程中发挥重要作用。2.癫痫细胞模型组磷酸化dynamin-1蛋白表达下降,转铁蛋白胞吞量增多,但抑制dynamin-1活性后,其表达与正常对照组无明显变化,同时正常对照组dynamin-1活性抑制前后磷酸化dynamin-1蛋白表达无明显差异。提示dynamin-1可能通过影响其磷酸化／去磷酸化及调节突触囊泡胞吞在癫痫发病机制中起重要作用,但对生理状态下正常细胞表达无影响。3.筛选了63个可能与dynamin-1存在相互作用的蛋白。证实endophilins和amphiphysins蛋白与dynamin-1存在相互作用关系。首次报道蛋白Rab GDI以及C1C-3与dynamin-1作用相关。