原发性肝癌在全球各种恶性肿瘤中发病率位居第五,病死率位居第三。在我国,原发性肝癌占全球的53%左右,其中80%以上是肝细胞癌,是第二位恶性肿瘤死亡原因。尽管过去几十年肝癌研究取得了可喜进展,但整个肝癌人群5年生存率仍只有5%左右。即使是根治性切除术后,5年复发率仍高达60-70%,术后高复发转移是响肝癌远期疗效的重要因素。因此,探寻肝癌复发转移相关分子机制对于提高肝癌疗效具有重要意义。Mina (Myc Induced Nuclear Antigen, Mina53)编码的蛋白分子量为53kDa,它主要定位于细胞核,部分浓缩于核仁。最初基于人早幼粒细胞白血病HL-60细胞系的研究发现它是癌基因c-myc的下游基因,受c-myc的直接调控参与细胞增殖过程。后续的研究发现Mina在肺癌、食管癌、结肠癌等组织中过表达且与患者不良预后相关,这可能与其促进肿瘤细胞增殖(Ki-67或PCNA免疫组化染色)有关。然而,作为癌基因c-myc直接的下游靶基因,Mina在肿瘤组织的表达水平并非总是与c-myc一致。它在早期肺癌的过表达甚至与患者良好预后相关,这与它作为c-myc共表达基因促进肿瘤增殖的身份不相吻合。从结构上说,Mina第128-271位氨基酸代表一个JmjC结构域,因此可能作为潜在的组蛋白甲基化调控酶。有研究表明,在非小细胞肺癌Mina可通过H3K9me3去甲基化调控核糖体基因的表达。此外,除了肿瘤细胞,Mina还可表达于间质细胞,例如来源于矿工的肺泡巨噬细胞和肝癌浸润淋巴细胞。新近更有研究表明,Mina可抑制IL-4的表达而使免疫平衡由Th2向Thl倾斜,而这种免疫平衡的偏移已被证实与人类多种肿瘤预后改善相关。以上结果提示Mina生物学功能的多样性,它可能并非只是c-myc的附属品,而可独立于c-myc影响细胞增殖以外的其他过程。有日本学者分析了53例外科切除肝癌组织标本免疫组化染色的结果发现：Mina在肝癌组织广泛过表达,且与细胞分化差、肿瘤直径大于2cm显著相关。然而,该研究并未提供肝癌组织Mina过表达的预后价值,它对肝癌细胞增殖、生长和侵袭等过程的影响也未经体外、体内实验加以证实。因此,关于Mina与肝癌进展的关系也就不得而知。GATA家族转录因子由一类含有1个或2个C2-C2锌指结构、从而能够识别DNA中A/T-GATA-A/G序列的蛋白组成,他们在器官发育和种系特化中具有重要作用。GATA家族含有六个成员,各自在不同的组织和器官具有特异性表达。GATA1和GATA2目前为止被认为是造血系统相关因子,在血液系统肿瘤领域被广泛研究。GATA3是经典的Th2淋巴细胞转录因子,决定CD4+幼稚T淋巴细胞向Th2亚型分化,同时在乳腺癌和胰腺癌的发生发展过程中具有重要作用,是乳腺癌重要的抑癌基因,对肿瘤的预后可能具有“双面性”。GATA4、GATA5和GATA6主要是内胚层因子,被证实在内胚层来源器官的正常或肿瘤组织中存在差异表达。GATA4、GATA5或GATA6由于启动子甲基化或核-浆转运机制异常导致的异位表达引起的失功能在肺癌、消化道肿瘤和卵巢癌中很常见,它可导致上皮细胞特异性标记物失表达而引起细胞去分化或下调抑癌基因潜在的靶基因。因此,靶向于GATA家族启动子甲基化或者核-浆转运机制异常是潜在的抗癌新疗法。肝脏属于内胚层起源器官,来自老鼠胚胎内胚层细胞的研究提示,在血清白蛋白基因肝脏特异性转录增强子区域存在GATA家族基因特异的结合位点,这种现象持续于肝脏发育的整个过程中,是血清白蛋白基因转录活性所不可缺少的。目前已有学者报道GATA家族转录因子表达于人肝癌细胞系HepRG、HepG2和Hep3B,并且与内皮细胞生长因子诱导的核酸切除修复活性及ERCC1的表达有关,而后者是铂类化疗在人类多种肿瘤产生耐药的重要机制之一。然而,目前没有任何报道研究GATA家族在肝癌和癌旁组织的表达模式及其对肝癌术后复发转移的影响。本课题拟研究Mina和GATA家族转录因子在正常肝和肝癌细胞系的表达；通过高通量组织芯片免疫组化技术分析它们在肝癌和配对癌旁组织的表达模式、与患者临床病理特征的关系及预后价值；借助慢病毒载体、裸鼠皮下瘤和裸鼠原位瘤模型研究Mina对于肝癌生物学特性的影响,试图寻找预测肝癌患者术后复发转移潜在的生物标记物。第一部分、肝癌组织Mina表达下降与患者不良预后相关目的：研究Mina蛋白在不同转移潜能肝癌细胞系以及肝癌和配对癌旁组织的表达水平,分析其与肝癌细胞系转移潜能、患者临床病理特征和预后的关系。方法：我们首先通过蛋白免疫印迹和细胞免疫荧光分析Mina蛋白在不同转移潜能人肝癌细胞系的表达水平及亚细胞定位,然后通过组织芯片免疫组化技术分析肝癌和癌旁组织Mina蛋白表达水平与患者临床病理特征和预后的关系。结果：Western blot结果提示,随着细胞系转移潜能增高,Mina蛋白表达水平显著下降(p=0.007),且发生胞核向胞浆异位表达,这种异位表达现象经细胞免疫荧光进一步证实。组织芯片免疫组化结果提示,Mina蛋白在肝癌组织的表达水平低于配对癌旁组织(阳性率,试验队列：癌171/230例,74.3%vs癌旁229/230例,99.6%；验证队列：癌61/86例,70.9%vs癌旁85/86例,98.8%)。在肝癌组织Mina蛋白主要定位于胞浆,而在癌旁和正常肝组织同时见胞浆、胞核表达。在试验队列,肝癌组织Mina蛋白低表达(染色指数≤1)与AFP阳性(p=0.004)、肿瘤直径大于5cm(p=0.002)、肿瘤无完整包膜(p=0.001)、细胞分化差(p=0.001)、癌栓阳性(p=0.001)、高TNM分期(p=0.001)和高BCLC分期(p=0.001)显著相关；在验证队列,肝癌组织Mina蛋白低表达与患者年龄小于52岁(p=0.005)、肿瘤细胞分化差(p=0.007)、癌栓阳性(p=0.016)和高TNM分期(p=0.040)显著相关。试验队列或验证队列癌旁Mina蛋白表达水平则与所有临床病理特征无显著关联。Kaplan-Meier单因素分析显示：在试验队列,癌组织Mina蛋白低表达与患者无复发生存时间(中位：16.0vs60.8月,p=2.0E-05)和总体生存时间(中位：17.0vs90.9月,p=7.1E-08)降低显著相关,Cox多因素分析提示它是肝癌患者术后复发(HR=0.57,95%CI=0.39-0.84,p=0.004)和死亡风险(HR=0.60,95%CI=0.41-0.87,p=0.008)增高的独立危险因素；而癌旁Mina蛋白表达水平则与患者复发或生存无显著关系。类似地,验证队列单因素分析结果提示肝癌组织Mina蛋白低表达与患者术后无复发生存时间(p=0.002)及总体生存时间(p=7.7E-05)下降显著相关,Cox多因素分析证实它是患者术后复发(HR=0.46,95%CI=0.24-0.88,p=0.019)和死亡(HR=0.35,95%CI=0.19-0.64,p=0.001)风险增高的独立危险因素。结论：随着肝癌细胞系转移潜能增高,Mina蛋白表达水平下降且由胞核向胞浆异位表达。类似地,Mina在肝癌组织也呈普遍的胞浆异位表达,肝癌Mina低表达与诸多预示肿瘤恶性潜能增高的临床病理因素(细胞分化差、无包膜、癌栓阳性等)密切相关,是预测患者术后复发和死亡的独立危险因素。第二部分、Mina抑制HepG2、SMMC-7721体外增殖、迁移和侵袭目的：研究Mina对于肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721体外增殖、迁移和侵袭能力的影响。方法：我们采用慢病毒转染系统特异性上调或下调Mina表达水平,通过CCK-8试剂盒、细胞划痕试验、transwell细胞迁移试验和transwell细胞侵袭试验研究Mina对于HepG2、SMMC-7721体外增殖、迁移和侵袭能力的影响。结果：细胞免疫荧光和Western blot结果显示,通过慢病毒转染系统可以稳定地下调HepG2或上调SMMC-7721细胞Mina蛋白的表达水平。CCK-8细胞增殖试验提示：下调Mina表达水平后,不同时间点HepG2增殖能力显著增强；而上调Mina蛋白表达水平后,SMMC-7721增殖能力则显著减弱。细胞划痕试验提示：下调HepG2细胞Mina表达水平后,其24小时(81.2±22.7vs139.6±22.6μm, p=0.011)和48小时(292.0±5.6vs351.3±38.4,p=0.022)迁移距离显著增宽；相反,过表达载体上调SMMC-7721细胞Mina表达水平后,其24小时(280.4±27.9vs210.1±22.0μμm,p=0.008)和48小时(359.0±50.4vs239.3±43.4,p=0.011)迁移距离显著缩短。Transwell细胞迁移试验证实了这种趋势：下调HepG2细胞Mina表达水平后,48小时后迁移细胞数量显著增加(262±48vs459±16个,p=0.002)；相反,上调SMMC-7721细胞Mina表达水平后,48小时后迁移细胞数量显著减少(485±33vs215±12个,p<0.0001)。Transwell细胞侵袭试验提示：下调HepG2细胞Mina表达水平后,48小时后侵袭细胞数量显著增加(431±30vs590±36个,p=0.007)；相反,上调SMMC-7721细胞Mina表达水平后,48小时后侵袭细胞数量显著减少(355±27vs181±32个,p=0.002)。结论：Mina显著抑制HepG2和SMMC-7721细胞体外增殖、迁移和侵袭的能力。第三部分、Mina抑制SMMC-7721原位瘤肝内转移目的：研究Mina对于裸鼠HepG2皮下瘤的生长以及SMMC-7721肝脏原位瘤生长、肝内转移的影响。方法：通过慢病毒转染系统结合裸鼠皮下瘤、裸鼠肝脏原位瘤模型研究Mina对于HepG2皮下成瘤以及SMMC-7721肝脏原位成瘤和肝内转移的影响。结果：HepG2裸鼠皮下瘤模型提示：与对照组(n=5)相比,RNAi组(n=5)肿瘤重量(1.9±0.65vs2.4±0.51g,p=0.267)和体积(2.8±1.28vs3.4±1.78cm3,p=0.559)均较大,但两组间差异无统计学意义。SMMC-7721原位瘤模型提示：与对照组相比(n=9),过表达组(n=9)肿瘤重量(0.8±0.44vs0.6±0.46g,p=0.414)较小,但两组间差异无统计学意义；然而,与对照组相比,过表达组肝内转移率显著降低(9/9vs2/9,p=0.002),且多呈弥漫转移。结论：Mina可显著抑制SMMC-7721肝脏原位瘤的肝内转移,但对HepG2皮下瘤或SMMC-7721原位瘤的生长无显著抑制作用。第四部分、GATA家族转录因子在肝癌的表达模式及预后意义目的：GATA家族转录因子是人类器官发育重要的决定性转录因子,与多种肿瘤的进展密切相关。本部分拟研究GATA家族在肝癌组织的表达模式及预后价值。方法：我们通过RT-qPCT和Western blot研究GATA家族成员GATA1、GATA2、 GATA4、GATA5和GATA6在正常肝细胞和肝癌细胞系的表达,通过组织芯片免疫组化分析它们在肝癌和癌旁组织的表达与患者临床病理特征和预后的关系。结果：GATA1在正常肝、肝癌细胞系或人肝癌组织中均完全缺失表达。RT-qPCR和Western blot发现GATA2mRNA和蛋白在肝癌细胞系表达低于正常肝细胞,在复发肝癌组织中表达低于未复发组织。免疫组化结果显示,相对于癌旁组织,肝癌组织GATA2表达下调而GATA4、GATA5和GATA6表达上调。在肝癌组织,GATA2表达下降与女性患者(p=0.008)、年龄大于52岁(p=0.028),术前AFP水平升高(p=2.7E-05)、肿瘤直径大于5cm(p=0.049)、肿瘤无包膜(p=0.002)、细胞分化差(p=0.005)、癌栓阳性(p=0.005)和高TNM分期(p=0.001)显著相关；而GATA4表达下降则与术前AFP水平阴性(p=0.014)和细胞分化较好(p=0.047)相关；GATA5和GATA6表达水平则与临床病理特征无显著关联。在癌旁组织,男性患者GATA2表达水平显著高于女性患者(p=0.003),癌旁组织其他GATA家族表达水平则与任何临床病理特征无显著关联。Kaplan-Meier单因素生存分析提示肝癌组织GATA2表达下调与无复发生存率(5年复发率,低表达组vs高表达组：69%vs47%,p=1.6E-04)和总体生存率下降(5年生存率：36%vs57%,p=1.7E-04)显著相关；癌旁GATA2表达水平则与患者术后复发或死亡无显著关联(p=0.180和0.104)。而无论癌组织还是癌旁组织,GATA4(癌：p=0.089和0.183；癌旁：p=0.114和0.381)、GATA5(癌：p=0.221和0.281；癌旁：p=0.088和0.174)或GATA6(癌：p=0.273和0.228；癌旁：p=0.173和0.953)表达水平均与患者复发或生存无显著关系。此外,术前血清AFP升高、肿瘤直径大于5cm、多发肿瘤、肿瘤无包膜、癌栓阳性和高TNM分期与患者术后无复发生存率和总体生存率降低显著相关,而肝硬化阳性、术前y-GT水平升高和细胞分化差也与术后总体生存率降低显著相关。Cox多因素分析证实癌组织GATA2表达是预测患者术后复发和死亡的独立危险因素,与低表达组相比,高表达组术后复发风险(H.R.=0.63,95%CI=0.43-0.90,p=0.012)和死亡风险(H.R.=0.67,95%CI=0.47-0.95,p=0.026)均显著下降。此外,多发肿瘤(p=0.010and p=0.009)和癌栓阳性(p=1.3E-08and p=1.8E-10)是术后复发或死亡风险提高的独立危险因素,而术前γ-GT水平升高(p=0.009)和细胞分化差(p=0.008))也是术后死亡风险提高的独立危险因素。进一步的分层分析发现,不管在接受辅助治疗组(p=0.039for TTR and p=0.005for OS)还是未接受治疗组(p=0.003for TTR and p=0.027for OS),癌组织GATA2表达水平均与患者术后复发或死亡风险显著相关。结论：造血相关转录因子GATA2在肝癌表达下降与患者不良预后显著相关。结论1.随着肝癌细胞系转移潜能增高,Mina蛋白表达水平下降,且由胞核向胞浆异位表达。与正常肝或配对癌旁组织相比,Mina蛋白在肝癌组织呈异位表达,表现为胞浆弥漫阳性,少见核阳性。肝癌组织Mina低表达与细胞分化差、癌栓阳性和高TNM分期等预示侵袭性增高的临床病理因素密切相关,是患者不良预后的独立预测指标。2. Mina可显著抑制HepG2、SMMC-7721细胞体外增殖、迁移和侵袭的能力。在体内Mina显著抑制SMMC-7721原位瘤的肝内转移,而对HepG2皮下瘤或SMMC-7721肝脏原位瘤的生长无显著影响。3.造血相关转录因子GATA1在人肝癌细胞系或组织完全失表达,GATA2则表达较丰富；内胚层相关转录因子GATA4、GATA5常见失表达,GATA6则部分保留。肝癌组织GATA2表达下调与诸多预示侵袭性增强的临床病理因素密切相关,是预测患者不良预后的独立危险因素。创新点1.首次采用大样本量、通过高通量组织芯片技术研究Mina和GATA家族转录因子在肝癌和癌旁组织的表达模式及预后价值。2.首次较系统地研究Mina对于肝癌细胞增殖、迁移、侵袭和肝内转移的影响。潜在应用价值1. Mina和GATA2可能作为预测肝癌术后复发转移的潜在分子标记物。2.研究Mina抑制肝癌侵袭、转移相关分子机制有助于揭示其真实身份。