本文以小鼠受精卵为研究对象，通过观察14-3-3蛋白和Cdc25B蛋白的表达和亚细胞定位情况；构建Cdc25B特异性位点突变表达载体，体外转录成mRNA；构建绿色荧光蛋白与Cdc25B的融合表达载体；将mRNA、Cdc25B蛋白抗体和pEGFP-Cdc25B重组载体显微注射入小鼠G1期受精卵，观察PKA/Cdc25B途径对小鼠受精卵早期发育的影响；构建含有突变位点的Cdc25B特定片段的原核表达载体，在体外表达出蛋白，为体外激酶底物磷酸化反应提供了基础。 实验材料：中国医科大学实验动物部提供昆明系雌、雄性小白鼠；pBSK-Cdc25B由TonyHunter教授(The Salk Institute)惠赠；pEGFP-C3载体由复旦大学刘喻博士惠赠；克隆载体pGEM-T Easy vector购于Promega公司；表达载体pBluescript Ⅱ/SK购于Stratagene公司；感受态E.coli JM109菌株购于宝生物有限公司；mMESSAGE mMACHINE体外转录试剂盒购于Ambion公司；QuickChange Site-Directed Mutagenesis Kit快速定点突变试剂盒购于Stratagene公司；质粒DNA提取试剂盒购于Qiagen公司；cdc2磷酸酪氨酸pTyr15抗体、14-3-3蛋白抗体、Cdc25B蛋白抗体购于Santa Cruz公司；小鼠Cdc258321位丝氨酸磷酸化抗体由Proteimech Group公司合成；限制性内切酶XhoI、BamHI、XbaI购于MBI公司；FITC标记的羊抗兔IgG、TRITC标记的兔抗山羊IgG购于北京中杉金桥生物技术有限公司；M2和M16培养液、Hoechst 33258和其它试剂购于Sigma公司。 实验方法： 1、小鼠超排卵及受精卵的采集和培养。取3-5周成熟雌性昆明系小鼠，腹腔内注射PMSG 10IU/只，46-48h后腹腔注射hCG10IU/只。当日将注射hCG后的雌鼠与成熟雄性小鼠合笼过夜。次日清晨检查雌鼠阴栓，有阴栓者视为交配成功，将其脱颈椎处死，取输卵管壶腹部，在实体显微镜下撕开壶腹部末端，让受精卵细胞团流出，透明质酸酶除颗粒细胞，用M2培养液洗受精卵，直至卵周无颗粒细胞。需要培养的受精卵移入M16培养液中，覆盖矿物油，在37℃、5％CO<,2>，饱和湿度的CO<,2>培养箱内培养。 2、间接免疫荧光实验。将各期受精卵放入2％多聚甲醛溶液固定30分钟，0.1％Triton x-100固定10min，PBS(含5％BSA)封闭40min。加入14-3-3抗体和Cdc25B抗体4℃过夜。次日加入FITC标记的IgG和TRITC标记的IgG 37℃ 1h。Hoechst 33258荧光染料37℃染色30分钟，使核酸着色，在荧光显微镜下分别观察14-3-3及Cdc25B蛋白在受精卵中的定位及核酸染色情况。 3、Cdc25B各种突变体的构建。以pBSK-Cdc25B-WT和pBSK-Cdc25B-S321A为模板，应用特异性引物，将Cdc25B 229位丝氨酸突变成丙氨酸，构建成pBSK-Cdc25B-S229A和DBSK-Cdc25B-S229A/S321A突变体表达载体，经DNA序列测定确定为成功引入突变。 4、绿色荧光蛋白融合表达载体的构建。限制性内切酶XhoI和BamHI将pBSK-Cdc25B-S229A/S321A、pBSK-Cdc25B-S321A、pBSK-Cdc25B-S229A、pBSK-Cdc25B-WT和pEGFP-C3载体双酶切后，利用T4DNA连接酶连接后构建成绿色荧光蛋白融合表达载体pEGFP-Cdc25B-S229A/S321A、pEGFP-Cdc25B-S321A、pEGFP-Cdc25B-S229A和pEGFP-Cdc25BS-WT。 5、体外转录： 各种重组体取1μg，经XbaI酶切线性化，应用体外转录试剂盒将制备好的线性模板体外转录成带帽mRNA，加入1μlDNase I，在37℃反应15min以消化DNA模板。用酚、氯仿抽提纯化mRNA，最后加入氯化锂沉淀mRNA，按需要浓度将mRNA溶于EDTA中。 6、显微注射： 显微注射应用EppendorfTrasferman显微操作系统，OlympuslX-70倒置显微镜，DIC调制相差观察。分别将各种mRNA、质粒、抗体注射到受精卵的细胞质或细胞核中。注射体积约10pl。设置TE缓冲液注射组和非注射组作为对照组。在hCG后25-35小时之间观察受精卵形态和卵裂率，对数据进行统计分析。 实验结果： 1、受精卵14-3-3蛋白和Cdc25B蛋白的表达与定位。小鼠1-细胞期胚胎14-3-3蛋白为同一种亚型，而且各期受精卵中14-3-3蛋白的表达水平无显著性差异(P>0.05)。在G1和S期Cdc25B蛋白被磷酸化，蛋白条带位于83kDa左右；G2期和M期蛋白去磷酸化，蛋白条带位于65kDa左右。G1期Cdc25B蛋白表达量很少，S期开始增加，G2期达到最大(对比于G1、S、M期表达水平有显著性差异，P<0.05)，M期又开始减少。免疫荧光实验表明，绿色荧光标记的14-3-3蛋白主要位于细胞质和细胞核中。红色荧光标记的Cdc25B蛋白在G1期位于细胞核及细胞质中，S和G2期主要位于细胞质皮质部分，M期位于整个细胞。14-3-3蛋白和Cdc25B蛋白在G1期共定位于细胞质和细胞核，在S期和G2期共定位于细胞质皮质部分，M期共定位于整个细胞(呈黄色荧光)。在M期受精卵中可看到绿色荧光蛋白标记的Cdc25B部分从细胞质转移到核区及其周围。 2、小鼠受精卵不同时期Cdc2-Tyr15的磷酸化状态检测。收集G1、S、G2和M期受精卵，检测Cdc2-Tyr15的磷酸化状态。G1期和S期可检测到很强的Cde2-Tyr15的磷酸化信号；在G2期Cdc2-Tyr15的磷酸化信号很弱；而M期未发现任何Cdc2-Tyr15的磷酸化信号。 3、Cdc25B野生型及各种突变体mRNA显微注射对小鼠受精卵卵裂率的影响及cdc2-Tyr15磷酸化状态的检测。为了观察Cdc25B蛋白对小鼠受精卵发育的作用，我们构建了不同的Cdc25B蛋白突变体，转录成mRNA，显微注射Nd,鼠受精卵中。结果显示Cdc25B-S229A/S321A组在hCG后26.5小时开始卵裂，卵裂率为90％；Cdc25B-S321A组在hCG后27小时开始出现卵裂，卵裂率为80.2％；Cdc25B-S229A组在hCG后27.5小时开始出现卵裂，卵裂率为75.2％；Cdc25B-WT 在hCG后28小时开始出现卵裂，卵裂率为75.5％。检测Cdc2.Tyr15的磷酸化状态发现正常对照组在hCG后26.5小时Cdc2-Tyr15处于磷酸化状态，28不时检测到极微弱的磷酸化，证明MPF开始激活；Cdc25B-S229A/S321A组、Cdc25B-S321A组、Cdc25B-S229A组、Cdc25B-WT组分别在264,时、27小时、27.5小时、28小时几乎检测不到Cdc2-Tyr15的磷酸化，证明MPF已经激活。 4、Cdc25B抗体显微注射对小鼠受精卵卵裂率的影响。对照组在hCG后28.5小时开始出现卵裂，至31小时已分裂成2-细胞期胚胎，卵裂率约61％左右，对照组组间卵裂率无显著性差异(P>0.05)；在小鼠受精卵G1期注射Cdc25B抗体，hCG后28.54,时仍处于1-细胞期，hCG后32小时开始卵裂，hCG后35小时只有10.9％的受精卵到达2-细胞期，与对照组相比有极显著差异(P<0.01)。 5、小鼠受精卵Cdc25B蛋白321位丝氨酸磷酸化状态的检测。分别收集1-细胞期胚胎的G1、S、G2、M期受精卵，应用Cdc258321位丝氨酸特异性磷酸化抗体检测各时期Cdc258321位丝氨酸的磷酸化状态。在G1和S期检测到磷酸化的Cdc25B，而G2和M期没有检测到任何Cdc258321 氨酸磷酸化信号，说明在G1和S期Cdc258321位丝氨酸被磷酸化，在G2和M期去磷酸化。 研究结论： 1、Cdc25B蛋白可以在不同时期的小鼠受精卵细胞质和细胞核之间进行穿梭，Cdc25B的核输出对于启动受精卵的有丝分裂是必须的。14-3-3蛋白可以通过调节Cdc25B的定位调控受精卵的发育。 2、Cdc25B蛋白对于受精卵的正常发育是必须的。 3、PKA的可能作用底物为Cdc25B，PKA主要通过磷酸化Cdc25B的321位丝氨酸，影响MPF的活性，从而促进受精卵的早期发育。 4、利用原核表达系统成功表达出四种GST-Cdc25B融合蛋白，为体外激酶底物磷酸化实验提供了基础。