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研究背景脊髓损伤主要分为外伤性脊髓损伤和非外伤性脊髓损伤,而外伤性脊髓损伤最为常见,它往往导致损伤节段以下肢体严重的功能障碍。脊髓损伤不仅会给患者本人带来身体和心理的严重伤害,还会对整个社会造成巨大的经济负担。针对脊髓损伤的预防、治疗和康复已成为当今医学界的一大课题。麻醉作为一种医疗干预手段,与手术患者的生命健康安全息息相关。随着人们教育背景的提升,健康观念的转变,手术的安全性和麻醉所带来的风险受到患者及家属的广泛关注。椎管内麻醉是常用的麻醉方法之一,主要通过穿刺技术将麻醉药物注入椎管的蛛网膜下腔或硬膜外腔,即神经根受到阻滞,使该神经根支配的相应区域产生麻醉作用,统称为椎管内麻醉。椎管内麻醉效果确切,对仪器设备要求低,可以为临床手术提供足够的镇痛作用,显著避免气道相关操作带来的呼吸系统并发症,并可在整个手术过程中保持与意识清醒的患者进行交流沟通,已广泛应用于外科手术中。不当的椎管内穿刺操作有可能使患者在一定时间内产生运动功能障碍,局部血管损害,最后造成局部微循环障碍,脊髓损伤病情也因上述因素而加重。电针疗法是一种有效的针灸方法,已成功用于治疗多种脊髓损伤相关疾病,它能有效恢复脊髓损伤中受损的中枢神经功能、抑制神经细胞的凋亡、改善损伤区微环境等。微小RNA(miRNA)是一类长约22nt的小非编码RNA。在大多数癌症中肿瘤原癌基因表达受到miRNA抑制作用影响,参与肿瘤细胞的各种生物过程,包括癌细胞代谢,增殖,侵袭和迁移以及诱导细胞自噬和细胞凋亡。脊髓损伤后的病理之一是神经元和轴突细胞的凋亡以及炎症反应。已有研究表明脊髓损伤所引发的病理生理变化受特定miRNA表达的严密调控,且脊髓损伤后,多种miRNA通过靶向调控抗炎细胞和促炎细胞因子的mRNA来调节脊髓损伤的炎症反应。然而电针疗法是否通过调控miRNA修复脊髓损伤我们尚不清楚。因此,本研究通过构建大鼠针刺造成的脊髓损伤模型,利用RNA测序技术,分析电针是否通过调控miRNA修复针刺造成的脊髓损伤并探讨其相关机制。第一部分电针治疗脊髓针刺损伤大鼠模型行为学和脊髓组织病理学形态观察目的检测电针疗法对脊髓针刺损伤的治疗效果。方法将18只SD大鼠分成假手术(Sham)组、穿刺损伤模型(SCI)组及穿刺损伤+电针治疗(SCI+EA)组(每组6只)。Sham组按手术步骤进行,无需其他操作;SCI组:做脊髓穿刺,但不做电针治疗;SCI+EA组:针刺损伤手术后三天开始每日电针刺激大椎穴、命门穴、夹脊穴进行治疗。各组的大鼠运动功能应用BBB评分法评价,并结合HE染色法对病理组织形态进行观察,脊髓组织中IL-1β和TNF-α的表达采用酶联免疫吸附实验(ELISA)法检测。结果(1)BBB评分结果显示,大鼠脊髓针刺损伤7天后,SCI+EA组大鼠BBB评分(20.50±0.55)显著高于SCI组(19.17±0.75),电针治疗21天后,SCI+EA组大鼠BBB评分(20.67±0.52)与Sham组(21.00±0.00)无显著差异,且显著高于SCI组(19.83±0.75)。电针治疗能明显改善脊髓针刺损伤大鼠运动功能。(2)观察脊髓病理形态学HE染色结果,发现电针治疗后,脊髓组织更加完整,细胞形态结构轮廓更加清晰,炎症相关细胞数目减少,正常神经细胞数量增加。(3)ELISA和qRT-PCR对炎症因子IL-1β和TNF-α进行检测,针刺脊髓损伤21天后,SCI+EA组TNF-α和IL-1β表达量分别为616.25 pg/mg和699.16pg/mg,明显低于SCI组(718.01 pg/mg,1360.62pg/mg)。表明电针治疗后,炎症因子在脊髓组织中表达下调,电针治疗可能通过减少炎症因子释放改善脊髓损伤。第二部分电针疗法修复脊髓针刺损伤功能的miRNA差异表达分析及功能注释目的利用小RNA(small RNA)测序技术筛选电针治疗脊髓损伤模型大鼠差异表达的miRNA。方法利用small RNA测序技术,确定SCI组和SCI+EA组大鼠miRNA表达谱;分析组间差异表达的miRNA,利用GO功能和KEGG代谢途径富集方法分析差异表达的miRNA;通过qRT-PCR检测5个随机挑选的miRNA的表达量,确定测序结果的可靠性。结果(1)利用small RNA测序技术,共筛选出168个差异表达miRNA,其中在SCI+EA组中,29个显著性上调,139个显著性下调。(2)综合多种数据库分析测序结果中差异表达miRNA的靶基因,最终预测到36336个靶基因。这些靶基因显著性富集在磷酸化、转录调控、DNA-模板化、蛋白质磷酸化等GO条目,并显著性富集在粘着力,胰岛素和轴突指导等信号通路。(3)qRT-PCR验证结果表明,与SCI组相比,SCI+EA组中rno-miR-219a-5p、rno-miR-128-3p、rno-miR-136-5p、rno-miR-7b表达下调,rno-miR-486表达上调,其中rno-miR-486和rno-miR-7b表达没有显著性。qRT-PCR结果与测序结果表达趋势相似,表明测序结果准确可信。第三部分miR-136-5p对大鼠小胶质细胞相关功能的影响目的进一步探讨在电针治疗修复针刺脊髓损伤修复过程中miR-136-5p调节小胶质细胞的功能。方法qRT-PCR检测小胶质细胞中转染miR-136-5p模拟物后3个靶基因的表达情况;用CCK-8法和流式细胞仪检测过表达miR-136-5p后,检测小胶质细胞的增殖和凋亡能力。结果(1)qRT-PCR验证3个靶基因结果显示,miR-136-5p mimics显著抑制Sema3a、Vangl2、Gng3表达,表明Sema3a、Vangl2、Gng3表达与miR-136-5p表达相关。(2)与对照组相比,小胶质细胞干扰miR-136-5p表达后,细胞增殖能力降低,细胞凋亡增多。结论本研究通过small RNA测序研究了电针疗法修复脊髓针刺损伤功能与未经电针治疗的miRNA差异表达谱,结果表明电针治疗后miR-136-5p表达下调。在体外小胶质细胞研究中发现,miR-136-5p促进小胶质细胞凋亡并抑制其细胞增殖能力;过表达miR-136-5p后显著抑制Sema3a、Vangl2、Gng3 mRNA表达,并且Vangl2蛋白表达。实验研究表明电针治疗通过下调miR-136-5p表达,抑制小胶质细胞增殖并促进其凋亡,并减少Vangl2蛋白表达,从而促进脊髓损伤恢复。