论文部分内容阅读
大豆茎溃疡病是大豆生产上的重要病害。大豆茎溃疡的病原菌分为大豆南方茎溃疡病菌[Diaporthe phaseolorum (Cke. & Ell.) Sacc. var. meridionalis Morgan-Jones](简称DPM)和大豆北方茎溃疡病菌[Diaporthe phaseolorum var. caulivora](简称DPC)。大豆南、北方茎溃疡病菌都属于子囊菌亚门、球壳目、间座壳科、间座壳属,无性阶段均为拟茎点霉属。能与大豆茎荚枯病菌和大豆拟茎点种腐病菌共同引起间座壳一拟茎点综合症,危害非常严重。由DPM和DPC分别引起的大豆南方茎溃疡病和大豆北方茎溃疡病在我国还未有发生的报道,这两种病害均为我国口岸的检疫病害。由于我国对大豆的需求量越来越大,而进口大豆中除大豆种子以外还混杂有豆荚、豆秆、碎叶片、以及田间的泥块等残渣,若这些成分中含有活着的大豆南、北方茎溃疡病菌,则很有可能由于目前口岸对这两种病原菌的检测技术较为落后而造成检测漏洞。若不能及时发现和阻止带菌大豆入境,使这两种病原菌在我国定殖、传播和危害,将会对我国的大豆生产产生严重影响。目前我国口岸对大豆南、北方茎溃疡病菌的检测技术还不是十分成熟,即使可以检测,也要花费较长时间,并且对人力、物力、所需仪器、实验条件等也有很高的要求。而口岸检疫最重要的一点就是病原菌的快速、准确的诊断。为此,本实验主要是基于环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)建立一种口岸DPM、DPC快速检测的技术体系。该技术体系由本实验室郑小波、沈浩等研发。由于进境的大豆残渣样本中含有豆荚、豆秆、碎叶片、多种微生物及田间的泥块等成分,那么该LAMP技术是否能在这些影响因素存在的情况下,准确的检测出材料中的DPM、DPC呢?所以我们首先在实验室条件下,采用向一定量的江苏省出入境检验检疫局提供的不含有DPM、DPC的大豆残渣样本中加入不同浓度梯度的DPM、DPC的孢子的方法对LAMP检测DPM.DPC的灵敏度进行研究。基于LAMP的DPM、DPC的检测灵敏度越高就越有利于提高在口岸检疫这两种病菌的检出效率。我们最终确定了在实验室条件下应用该LAMP技术检测DPM、DPC的灵敏度,分别为10～50个孢子/10g大豆残渣、1-10个孢子/10g大豆残渣。在确定了在实验室条件下研发的该LAMP的DPM、DPC快速分子检测随技术可应用于口岸截获的大豆残渣样本的检测后,我们就对江苏省出入境检验检疫局提供的口岸截获的11份大豆残渣样本进行DPM、DPC的LAMP实际检测。检测出该11份豆渣样本中有3份携带有DPC、均未携带DPM。病菌的传播是建立在活体的基础上。江苏省出入境检验检疫局提供的11份大豆残渣样本进行DPM、DPC的LAMP检测后,对DPC检测结果为阳性的有3份豆渣样本。但并不清楚是否含有DPC活菌。所以,我们对该3份大豆残渣样本中携带的DPC进行分离、纯化。最后从2号(巴西,201304005)大豆残渣样本中分离出了DPC。本实验应用环介导等温扩增技术对口岸大豆南、北方茎溃疡病菌进行检测的实际检测结果表明：LAMP技术对口岸大豆南、北方茎溃疡的检测是可行并且检测灵敏度较高的一种新的简便、快捷的检测方法。本实验成功的建立了一个基于LAMP技术、适用于我国口岸检验检疫进口大豆中DPM、DPM病菌的快速检测体系。