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背景食管癌是严重的消化道恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率分别位居全球癌症第七位和第六位。食管癌主要分成两种不同的组织学类型:食管鳞状细胞癌(Esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(Esophageal adenocarcinoma,EAC),其中鳞状细胞癌约占食管癌的90%。手术切除和放疗化疗是治疗晚期食管鳞癌的常用手段,但由于其治疗的局限性,且患者对经典化疗药物易产生耐药,导致食管鳞癌的五年生存率仍较低。早期的干预和治疗能够有效抑制食管鳞癌的发展,因此寻找新的安全有效的食管鳞癌治疗药物成为当务之急。中国是中草药大国,有着丰富的中草药资源。从中草药中提取的天然产物显示出很强的抗癌活性,例如槲皮素、大黄素、小檗碱和紫杉醇等。青蒿素是我国科学家屠呦呦等人从黄花蒿中提取分离的一种过氧化物基团的倍半萜内酯,能够有效破坏疟原虫的细胞结构和功能,是抗疟疾的一线药物。除了在疟疾方面有显著的治疗效果,越来越多的证据表明,青蒿素类药物具有预防和治疗癌症的巨大潜力。研究表明青蒿素类药物对乳腺癌、结肠癌、胃癌、宫颈癌等癌症均有抑制增殖的作用,并且作用机制复杂,调节NFκB、Survivin、NOXA和 Bim-1 等关键因子,涉及 Jak2/STAT3、Wnt/β-catenin、Cyclin D1-CDK4-Rb signaling等多条信号途径。目前,有证据表明青蒿素衍生物双氢青蒿素(Dihydroartemisinin,DHA)可以剂量依赖的方式降低食管癌细胞的活力,但详细的作用机制还有待探索。在本研究中,我们从体内外水平探究双氢青蒿素对食管鳞癌增殖的抑制作用,并积极寻找其作用靶点和有关分子机制。方法1.细胞毒性实验:分别用不同浓度的双氢青蒿素处理人食管鳞癌细胞KYSE30和KYSE150,经4%多聚甲醛固定和DAPI染色后,检测药物作用鳞癌细胞24h和48 h后的细胞数,并计算24 h和48 h的各个浓度下细胞的存活率。2.细胞生长抑制实验:不同浓度双氢青蒿素(0、1、5、10、15μM)分别处理人食管鳞癌细胞KYSE30和KYSE150,用4%多聚甲醛固定药物作用不同时间(0、24、48、72、96 h)的细胞,经DAPI染色后检测细胞数,记录各个时间点的细胞数并绘制生长曲线,评价双氢青蒿素对人食管鳞癌细胞生长的抑制作用。3.软琼脂克隆形成实验:在双氢青蒿素工作浓度为0、1、5、10、15 μM的琼脂培养基中分别接种KYSE30和KYSE150细胞,细胞生长8 d后拍照并计算各个浓度下的克隆数,检测双氢青蒿素对人食管鳞癌细胞克隆形成能力的抑制作用。4.细胞周期实验:不同浓度双氢青蒿素(0、1、5、10、15μM)分别处理人食管鳞癌KYSE30和KYSE150细胞,药物作用细胞24 h后经碘化丙啶染色,利用流式细胞术检测双氢青蒿素对食管鳞癌细胞的周期影响。5.磷酸化蛋白质组学分析:食管鳞癌KYSE30细胞经双氢青蒿素(0、10 μM)处理12h后,进行基于质谱的磷酸化蛋白质组学分析。6.激酶芯片:食管鳞癌KYSE30和KYSE150细胞经双氢青蒿素(0、10μM)处理12 h后,进行磷酸激酶抗体芯片检测。7.免疫印迹和免疫荧光实验:分别采用免疫印迹和免疫荧光实验验证磷酸化蛋白质组学结果,另外用免疫印迹实验对mTOR、p70S6K、RPS6总蛋白水平及磷酸化水平进行检测。8.Pull down实验:将提前与双氢青蒿素结合的Sepharose 4B珠子与食管鳞癌细胞裂解液共孵育后,洗脱未与Sepharose 4B珠子上药物结合的细胞蛋白质,利用Western blotting检测双氢青蒿素与mTOR蛋白的上游AKT1和p70S6K激酶结合效果。9.体外激酶实验:采用体外激酶实验,检测双氢青蒿素对AKT1和p70S6K激酶体外磷酸化mTOR过程的抑制作用。10.人源性组织异种移植模型(patient-derived xenografts,PDX):将不同浓度双氢青蒿素(0 mg/kg、25 mg/kg、50 mg/kg)腹腔注射到人食管鳞癌组织异种移植模型SCID小鼠中,检测不同浓度的双氢青蒿素对小鼠移植瘤增殖的影响。11.免疫组织化学实验:采用免疫组织化学实验对小鼠移植瘤组织中p-mTOR、p-p70S6K、p-RPS6磷酸化水平进行检测,评价双氢青蒿素对mTOR、p70S6K、RPS6通路的影响。结果1.根据细胞毒性实验的各个浓度的细胞生存率确定双氢青蒿素的实验浓度为:0、1、5、10、15μM。2.细胞生长抑制实验和软琼脂克隆形成实验结果表明,双氢青蒿素能够抑制人食管鳞癌细胞的生长。随着药物作用的浓度增加,双氢青蒿素抑制鳞癌细胞生长和克隆形成的效果也更加显著。3.细胞周期实验结果表明,随着浓度的增加,双氢青蒿素阻滞食管鳞癌细胞于G0/G1期。双氢青蒿素可以升高抑制周期依赖激酶复合物活性的p21蛋白,降低细胞周期蛋白依赖性激酶CDK2的表达水平。4.磷酸化蛋白质组学分析和激酶芯片及免疫印迹实验综合结果表明,双氢青蒿素影响食管鳞癌细胞的p70S6KT389、p70S6KT421/S424和RPS6S235/S236磷酸化蛋白质的表达水平,下调mTOR-p70S6K-RPS6信号通路。5.Pull down和体外激酶实验的结果表明双氢青蒿素可与AKT1、p70S6K激酶分别结合并抑制AKT1、p70S6K激酶对mTORS2448的磷酸化效应。6.PDX模型实验结果表明双氢青蒿素可抑制人源性食管鳞癌肿瘤的增殖。7.免疫组化实验结果表明双氢青蒿素可降低PDX模型SCID小鼠移植瘤组织中mTOR、p70S6K、RPS6蛋白的磷酸化水平。结论双氢青蒿素通过靶向AKT1、p70S6K激酶下调mTOR-p70S6K-RPS6信号通路抑制食管鳞癌的增殖。